ОБЩАЯ И ПИЩЕВАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ЧАСТЬ I - Л. В. Красникова - 2016
4. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
Цель работы: дать представление о разновидностях питательных сред, используемых для выращивания микроорганизмов; ознакомить студентов с методами посева и пересева микроорганизмов.
Выращивание микроорганизмов на питательных средах называют культивированием (от лат. cultus - выращивание), а развившиеся при этом микробы - культурой. Различают чистую культуру, являющуюся потомством клеток только одного вида; накопительную культуру, в которой преобладают клетки одного вида или группы родственных микроорганизмов, и смешанную культуру, представляющую собой консорциум нескольких видов микроорганизмов.
Внесение какого-либо исследуемого материала (пробы воды, продукта, образца почвы и т. д.) в стерильную питательную среду называется посевом. Перенесение уже выращенной культуры в стерильную среду называется пересевом, а при многократных пересевах - пассированием (от лат. passis - чередование).
При культивировании микроорганизмов важно создать оптимальные условия для их роста. Основными факторами, влияющими
на скорость роста, являются температура, рН среды, наличие или отсутствие кислорода, состав и свойства среды.
Микроорганизмы выращивают при оптимальной для каждого из них температуре в термостатах или термостатных комнатах. Этот процесс называется инкубацией, илиинкубированием (от лат. incubatio - выращивание, высиживание птенцов). В частности, мезофильные микроорганизмы выращивают при температуре от 25 до 30 °С, термофильные - при температуре 40-45 °С, бактерии группы кишечной палочки - обычно при температуре 37 °С.
Микроорганизмы весьма требовательны к реакции среды. Поэтому до стерилизации необходимо установить требуемое значение рН среды с учетом снижения его на некоторую величину после стерилизации.
Культивирование микроорганизмов в лабораторных условиях осуществляют в стеклянной посуде: колбах, пробирках, чашках Петри, матрацах (плоских стеклянных бутылях), в жидкой среде (бульоне), в молоке или на плотных питательных средах.
Чистые культуры микроорганизмов обычно выращивают в пробирках на скошенном агаре или в бульонной среде. Если для выращивания в пробирках требуется плотная среда, то при подготовке к стерилизации расплавленную среду наливают на 1/3-1/4 объема пробирки. После стерилизации пробирки с незастывшей средой раскладывают в наклонном положении. Пробирки с застывшей средой называют косяками.
Для выращивания аэробных бактерий в жидкой среде пробирку заполняют питательным бульоном на 1/3, а для анаэробных бактерий - на 2/3. Характерными признаками роста микроорганизмов в бульоне являются равномерное помутнение, образование пленки на поверхности, наличие осадка определенного типа и др.
Пробирки, заполненные на 1/2 объема застывшей плотной средой, называют столбиками. Их используют для посева культуры уколом.
Для выращивания микроорганизмов в колбах используют только жидкие питательные среды, а в чашках Петри - плотные.
В чашках Петри, как правило, культивируют аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы. Они образуют на поверхности плотной питательной среды колонии определенного типа.
Для культивирования анаэробных бактерий используют специальные приборы - анаэростаты (рис. 4.1).
Рис. 4.1. Анаэростат
Анаэростат представляет собой цилиндр, который через вакуумную резиновую прокладку закрывают крышкой. На крышке анаэростата расположены вакуумметр и два крана: один присоединяется к насосу, откачивающему воздух, другой - к баллонам с газами (N2, СO2, Н2). После размещения чашек или пробирок из анаэростата удаляют воздух при помощи вакуумного насоса, затем кран перекрывают специальным винтом, анаэростат разъединяют с вакуумным насосом и переносят его в термостат.
4.1. Питательные среды
Для обнаружения и количественного учета микроорганизмов в пищевых продуктах, их выделения и изучения свойств используют разные по составу и назначению питательные среды. Любая питательная среда должна отвечать следующим требованиям: содержать все необходимые для питания микроорганизмов вещества в легко усвояемой форме, иметь оптимальные влажность, вязкость, рН, быть изотоничной и по возможности прозрачной. Каждую питательную среду стерилизуют определенным способом в зависимости от ее состава.
По составу различают синтетические и натуральные питательные среды.
Синтетические среды представляют собой водные растворы определенных химически чистых соединений в установленных дозировках, т. е. их состав полностью известен. Однако лишь для немногих нетребовательных к питанию микроорганизмов используют синтетические питательные среды.
Натуральные, или естественные, среды состоят из продуктов растительного или животного происхождения и имеют сложный неопределенный химический состав. К ним относятся мясопептонный бульон и агар, солодовое сусло и сусло-агар, обезжиренное и гидролизованное молоко, отвары различных овощей и т. д.
По целевому назначению питательные среды делят на основные, элективные и дифференциально-диагностические.
Основными являются среды, которые применяют для выращивания многих бактерий. К ним относятся мясопептонный бульон (МПБ), триптические гидролизаты мясных, рыбных продуктов, казеина. Такие среды служат основой для приготовления сложных питательных сред. К ним добавляют кровь, сахар, молоко и другие ингредиенты.
Элективные, или избирательные, среды были введены в микробиологическую практику С.Н. Виноградским и М. Бейеринком. Они предназначены для выделения и накопления микроорганизмов определенного вида (или определенной группы) из объектов, содержащих разнообразную микрофлору. Сопутствующие микроорганизмы или совсем не растут на таких средах или развитие их сильно подавлено. Разработка элективных сред основана на биологических особенностях, отличающих данные микроорганизмы от многих других.
Дифференциально-диагностические среды позволяют по возможности быстро установить и отличить (дифференцировать) одни виды или группы микроорганизмов от других. Их состав подбирается с таким расчетом, чтобы можно было четко выявить наиболее характерные свойства данного вида. Часто это достигается введением в среды специальных красителей-индикаторов, которые окрашивают колонии выявляемых микроорганизмов в определенный цвет. В частности, для выявления бактерий группы кишечной палочки используют дифференциально-диагностические среды Эндо, Кесслера, Эйкмана, Плоскирева, Левина и др.
По физическому состоянию среды разделяют на жидкие, полужидкие, плотные, сухие.
Жидкие среды (бульоны) используют для накопления биомассы микроорганизмов или продуктов их метаболизма, а также для выявления физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов.
Полужидкие среды содержат от 0,08 до 0,7 % агара.
Плотные среды готовят из жидких путем добавления к ним желирующих веществ - желатина или агара (1,5 — 2,0 %). Оба эти вещества при растворении в горячей воде образуют коллоидный раствор, дающий при охлаждении плотный студень (гель). Студнеобразные среды можно вновь расплавлять нагреванием. Плотные среды используют для выделения чистых культур микроорганизмов, в диагностических целях (описание выросших на среде колоний), для количественного учета микроорганизмов, определения антагонистической, протеолитической активности и т. д.
Сухие питательные среды, выпускаемые специальными предприятиями, используют в микробиологических целях путем добавления в них воды с последующей стерилизацией.
4.2. Техника посевов микроорганизмов на питательные среды
Для работы с микроорганизмами используют специальные бактериологические петли, иглы, шпатели, пипетки. Посевы всегда проводят в зоне пламени горелки. Около работающего с чистой культурой нельзя делать резких движений, ходить, кашлять и т. п., так как движение воздуха увеличивает опасность попадания посторонних микроорганизмов в пробирку с культурой. Поэтому посевы и пересевы микроорганизмов рекомендуется проводить в боксе. Бокс представляет собой небольшое изолированное помещение, разделенное перегородкой на две части. В основное помещение бокса входят через тамбур, в котором должны висеть халаты, предназначенные только для работы в боксе. Все оборудование бокса, его стены и пол регулярно моют и протирают дезинфицирующими веществами. Перед работой бокс стерилизуют при помощи бактерицидных ламп в течение 1,0 — 1,5 ч.
Посев в жидкую питательную среду. Посев производят петлей или градуированной пипеткой. Посевной материал бактериологической петлей осторожно вносят в пробирку и легко встряхивают в верхнем слое питательной среды или растирают по стенке, смывая его жидкой средой.
Стерильную пипетку опускают в пробирку с культурой, отбирают определенное количество материала и переносят его в пробирку со свежей питательной средой, выпуская жидкость по стенке пробирки, или вносят пипетку вглубь среды и выпускают содержащийся в ней материал.
Посев штрихом в пробирку со скошенным агаром. Пробирку с культурой и пробирку со скошенным питательным агаром берут в левую руку и держат в наклонном положении. В правую руку берут бактериологическую иглу и прокаливают ее в пламени спиртовки до покраснения, затем проносят сквозь пламя иглодержатель. Мизинцем правой руки вынимают пробки из обеих пробирок, обжигают края пробирок. Петлю вводят в пробирку с культурой, охлаждают ее о края пробирки и осторожно снимают небольшое количество микробной культуры. Петлю с посевным материалом быстро переносят в пробирку со стерильной средой и опускают почти до дна, где скапливается небольшое количество конденсационной влаги. Слегка касаясь агара, проводят зигзагообразную линию, при этом петлю не отрывают от поверхности питательной среды. После посева петлю вынимают из пробирки и обжигают вместе с остатками посевного материала. Затем обжигают края пробирок и внутренние концы пробок, после чего пробирки закрывают. На наружной поверхности пробирки пишут дату посева и наименование культуры.
Посев уколом. Профламбированной бактериологической иглой берут исследуемую культуру. Пробирку со столбиком питательной среды берут в правую руку, переворачивают вверх дном, вынимают из нее пробку, прижимая мизинцем к ладони. Подняв пробирку на уровень глаз, в центре столбика прокалывают плотную среду иглой снизу-вверх на всю глубину. Затем иглу извлекают, пробирку закрывают пробкой, подписывают и помещают в термостат для выращивания.
Посев на поверхность среды в чашку Петри. В чашки Петри заливают расплавленный агар, дают ему застыть и подсушивают в термостате. Посев проводят бактериологической петлей или шпателем Дригальского (стеклянная палочка, согнутая в виде треугольника). При использовании петли посев осуществляют штриховым методом. Крышку чашки Петри слегка приоткрывают настолько, чтобы в образующуюся щель проходила петля. Петлю кладут плашмя на питательную среду, чтобы не поцарапать ее, и наносят микробную культуру зигзагообразными движениями (штрихом) по всей поверхности агара, не отрывая от среды, что дает возможность получить изолированные колонии.
Посевы «газоном» производят шпателем. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку чашки Петри, петлей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара. Затем проводят шпатель сквозь пламя горелки, остужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают материал по всей поверхности среды. После инкубации посевов в чашке появляется равномерный газон выросшей культуры.
Глубинный посев в чашку Петри. Определенное количество подготовленного к посеву исследуемого материала (1,0 или 0,1 см3) вносят пипеткой в пустую чашку Петри. Из пробирки или колбы с расплавленной и остуженной до 45 °С питательной средой вынимают пробку, обжигают края в пламени горелки и, слегка приоткрыв крышку, выливают на дно чашки.
Пробирки и чашки с посевами помещают в термостат с температурой, оптимальной для конкретного микроорганизма. Как правило, мезофильные бактерии выращивают при температуре 37±1 °С, термофильные бактерии - при 40-55 °С, дрожжи и плесени - при 30±1 °С.
Контрольные вопросы
1. Что такое чистая, накопительная и смешанная культура?
2. Как классифицируют питательные среды по составу компонентов и назначению?
3. Какие среды позволяют получить преимущественный рост одних микробов при одновременном подавлении роста других?
4. Какими методами производят посев микроорганизмов на питательные среды?
5. Как осуществляют культивирование аэробных и анаэробных бактерий?