ОБЩАЯ И ПИЩЕВАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ЧАСТЬ II - Л. В. Красникова - 2016
ТЕМА 9. ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ТЕХНОЛОГИИ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ
В биотехнологии ферментированных молочных продуктов используют разные группы микроорганизмов: молочнокислые, пропионовокислые, уксуснокислые бактерии, бифидобактерии, дрожжи, мицелиальные грибы. Наиболее важную роль играют молочнокислые бактерии.
9.1. Молочнокислые бактерии
Молочнокислые бактерии (МКБ) расщепляют углеводы с образованием преимущественно молочной кислоты, благодаря чему они и объединены в одну группу. Кроме молочной кислоты эти бактерии накапливают и другие метаболиты: уксусную кислоту, этанол, диоксид углерода, летучие вещества (ацетальдегид, диацетил, жирные кислоты).
Морфология. По форме клеток МКБ бывают шаровидной и палочковидной формы. Они грамположительны, неподвижны, не образуют спор и капсул (в молодых культурах некоторые штаммы формируют слизистую капсулу). Исключение составляет один род - Sporolactobacillus, клетки которого подвижны и образуют эндоспоры.
Физиолого-биохимические признаки. По отношению к кислороду МКБ являются факультативными анаэробами. Молочнокислые бактерии - единственная группа микроорганизмов, лишенных каталазы, но способная расти в присутствии кислорода воздуха. Функцию каталазы у них выполняет фермент лактопероксидаза. У МКБ отсутствуют гемсодержащие ферменты, поэтому энергию они получают только в процессе молочнокислого брожения, которое условно разделяют на гомоферментативное и гетероферментативное. При гомоферментативном брожении основным метаболитом является молочная кислота; при гетероферментативном кроме молочной кислоты образуются также диоксид углерода, этанол и/или уксусная кислота.
Температурный диапазон жизнедеятельности лактобактерий довольно широк: мезофильные виды растут при оптимальной температуре 25-32 °С; минимальной температурой для них является 10 °С. Для термофильных видов оптимальная температура роста колеблется в пределах 38-45 °С, а минимальная - от 20 до 22 °С. Имеются сведения, что некоторые молочнокислые бактерии способны расти при температуре 3-5 °С.
В настоящее время в группу молочнокислых бактерий входят 13 родов, в том числе:
✵ Шаровидные: Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Pediococcus, Lactosphaera, Oenococcus, Tetragenococcus, Va- gococcus, Weis sella.
✵ Палочковидные: Carnobacterium, Lactobacillus, Paralactobacillus.
Шаровидные молочнокислые бактерии. Из шаровидных МКБ в молочной промышленности используются лактококки подвидов Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. diacetylactis; стрептококки подвида Streptococcus salivarius subsp. thermophilus; лейконостоки подвидов Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris и Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum, свойства которых приведены ниже.
Lactococcus lactis subsp. lactis (молочнокислый стрептококк, сокращенно Lac. lactis). Клетки сферические или овальные размером 0,5-1,2 x 0,5-1,5 мкм, соединенные попарно (диплококки) или в виде коротких цепочек (рис. 9.1, а). Оптимальная температура роста развития 28-32 °С.
Активные штаммы этого вида свертывают молоко за 4-6 ч, образуя ровный плотный сгусток. Предельная кислотность (определяется через 5-7 сут. инкубации в молоке при оптимальной температуре) достигает 120-125 °Т. Lac. lactis ssp. lactis восстанавливает и свертывает лакмусовое молоко, разлагает аргинин с образованием аммиака, не растет в средах с 6,5 %-м NaCl и в щелочной среде с рН 9,5. Штаммы этого вида входят в состав заквасок для кисломолочных напитков, творога, сметаны, кислосливочного масла, сыров с низкой температурой второго нагревания.
Отдельные штаммы Lac. lactis синтезируют бактериоцин низин, обладающий антагонистической активностью по отношению к большинству грамположительных бактерий (стафилококков, микрококков, бацилл, клостридий, лактобактерий и др.). На грам отрицательные бактерии низин не оказывает ингибирующего влияния. Низин используется в консервной промышленности для подавления развития спорообразующих бактерий.
Lactococcus lactis subsp. cremoris (сливочный стрептококк - Lac. cremoris). Клетки шаровидные, располагаются в виде коротких и длинных цепочек (рис. 9.1, б). Оптимальная температура роста 25-30 °С, при температуре 39-40 °С рост прекращается. Молоко свертывается за 6-8 ч, образуя плотный сгусток слегка вязкой или сметанообразной консистенции, что обусловлено способностью сливочного стрептококка синтезировать полисахариды. Предельная кислотность в молоке составляет не более 110-115 °Т.
Штаммы этого вида не образуют аммиак из аргинина, не растут в средах с 4 %-м NaCl и с рН 9,5. Сливочный стрептококк используется в заквасках для сметаны, кислосливочного масла и других кисломолочных продуктов.
Некоторые штаммы этого подвида синтезируют бактериоцин лактококцин.
Lactococcus lactis subsp. diacetylactis (ароматобразующий стрептококк - Lac. diacetylactis). Клетки расположены в виде диплококков и коротких цепочек (рис. 9.1, в). Оптимальная температура роста 25-30 °С. Имеет довольно слабую кислотообразующую активность, молоко свертывает за 16-18 ч, предельная кислотность не превышает 70-100 °Т. Сгусток молока плотный, часто с наличием пузырьков газа (СО2), имеет приятный специфический запах, обусловленный накоплением диацетила. Штаммы этого вида расщепляют лактозу и цитраты с образованием диоксида углерода, диацетила и ацетоина. В утилизации цитратов участвуют два фермента - цитратпермеаза, транспортирующая цитрат в клетку через цитоплазматическую мембрану, и цитратлиаза, расщепляющая цитрат на ацетат и оксалоацетат. Фермент диацетилредуктаза, присутствующий в клетках, восстанавливает диацетил до ацетоина, что приводит к снижению аромата. Этот процесс можно замедлить путем быстрого охлаждения ферментированных молочных продуктов.
Ароматобразующий стрептококк входит в состав заквасок для большинства ферментированных молочных продуктов.
Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris (Leuc. cremoris). Клетки шаровидные или линзовидные размером 0,5-0,7 x 0,7-1,2 мкм, соединены попарно или в короткие цепочки (рис. 9.1, г). Оптимальная температура роста 22-25 °С, минимальная - около 5 °С. Молоко не свёртывает, так как обладает низкой протеиназной активностью. Лейконостоки способны расти в молоке при добавлении в него ростовых факторов (дрожжевого или кукурузного экстракта). Предельная кислотность не превышает 40-50 °Т. После снижения рН среды до 5,0-4,5 образует диацетил, поэтому данный вид используют в многовидовых заквасках для производства сыров и кислосливочного масла в сочетании с Lac. lactis и Lac. cremoris.
Рис. 9.1. Шаровидные молочнокислые бактерии: а - Lac. lactis; б - Lac. cremoris; в - Lac. diacetylactis; г - Leuc. cremoris; д - S. thermophilus
Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (термофильный стрептококк - S. thermophilus). Клетки имеют овальную или шаровидную форму диаметром 0,7 — 1,0 мкм, часто соединены в длинные цепочки (рис. 9.1, д). Активные штаммы свертывают молоко за 3,5-4 ч при оптимальной температуре 40-42 °С. Температурный диапазон роста - 20-50 °С. S. thermophilus относительно термоустойчив, он может выдерживать температуру 75 °С в течение 15 мин, поэтому входит в состав остаточной микрофлоры пастеризованного молока.
Предельная кислотность в молоке не превышает 100-115 °Т. Термофильный стрептококк чувствителен к содержанию в среде натрия хлорида и антибиотиков: он перестает расти в среде, содержащей 4 % NaCl и 0,01 МЕ/см3 пенициллина.
Некоторые штаммы термофильного стрептококка образуют диацетил и способны синтезировать экзополисахариды, что приводит к формированию вязкого слизистого сгустка.
Термофильный стрептококк вводят в состав заквасок для производства ряженки, варенца, йогурта, сыров с высокой температурой второго нагревания.
Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum (Leuc. dextrani- cum) морфологически схож с Leuc. cremoris. Свертывает молоко при оптимальной температуре 22-25 °С в течение 3-4 сут. Предельная кислотность составляет 70-80 °Т.
Размножение лейконостоков стимулирует добавление в среду марганца, что приводит также к повышенному синтезу метаболитов: диацетила, уксусной кислоты, диоксида углерода.
Лейконостоки входят в состав естественной микрофлоры кефирного грибка и играют большую роль в формировании его вкуса и запаха.
Многие штаммы Leuc. dextranicum синтезируют из сахарозы полисахарид декстран, образующий слизь.
Палочковидные молочнокислые бактерии включены в семейство Lactobacillaceae, род Lactobacillus, который подразделяют на три подрода: Thermobacterium (термобактерии), Streptobacterium (стрептобактерии) и Betabacterium (бетабактерии по Орла-Йенсену).
По типу брожения лактобациллы распределены на три группы:
I - облигатно гомоферментативные (термобактерии);
II - факультативно гетероферментативные (стрептобактерии);
III - облигатно гетероферментативные (бетабактерии).
В молочной промышленности используют следующие виды лактобацилл (рис. 9.2, а-и):
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (болгарская палочка, сокращенно L. bulgaricus). Форма клеток в молоке - длинные и короткие палочки размером 5-20 x 0,8-1,0 мкм (рис. 9.2, а). При окрашивании препаратов из молока метиленовым синим в клетках часто наблюдаются зёрна полифосфатов, иногда неравномерно окрашенные участки цитоплазмы. Оптимальная температура развития 40-45 °С. Молоко свертывает за 4-6 ч. Предельная кислотность молока достигает 200-300 °Т. Сгусток молока может иметь колющуюся или сильно вязкую слизистую консистенцию. Штаммы болгарской палочки образуют ацетальдегид, придающий сгустку характерный фруктовый запах. Болгарская палочка чувствительна ко многим антибиотикам, присутствующим в сыром молоке, но устойчива к бактериофаговой инфекции.
Рис. 9.2. Палочковидные молочнокислые бактерии: а - L. bulgaricus; б - L. acidophilus; в - L. lactis; г- L. helveticus; д - L. rhamnosus; е - L. plantarum; ж - L. fermentum; з - L. brevis; и - L. саsei
Штаммы болгарской палочки входят в состав заквасок для производства йогурта, простокваш южной, болгарской, мечниковской.
Lactobacillus acidophilus (ацидофильная палочка). Форма клеток в молоке: длинные и короткие палочки размером 3-40 мкм, толщиной 1,0-1,5 мкм (рис. 9.2, б). У некоторых штаммов так же, как и у болгарской палочки, в клетках наблюдается «зернистость». Оптимальная температура развития 37-38 °С. Молоко свертывает за 5-8 ч, предельная кислотность молока - 260-280 °Т. Некоторые штаммы образуют слизистый сгусток.
Ацидофильная палочка является нормальным представителем кишечной микрофлоры человека и теплокровных животных. Поэтому она устойчива к щелочной реакции среды (рН 8,3), наличию в среде фенола (0,3-0,4 %), желчи (20 %).
Ацидофильная палочка обладает высокой антагонистической активностью по отношению к гнилостной, условно-патогенной и патогенной микрофлоре. Она подавляет рост сальмонелл, шигелл, золотистого стафилококка, эшерихий и др. Это объясняется тем, что ацидофильная палочка синтезирует несколько бактериоцинов: ацидофилин, лактоцидин, ацидоцин B, лактоцины B и F. Поэтому L. acidophilus относят к ценным пробиотическим культурам.
Молочнокислые палочки данного вида применяют для приготовления ацидофилина, ацидофильного молока, детских кисломолочных продуктов.
Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis (молочнокислая палочка - L. lactis). По морфологическим и биохимическим признакам схожа с болгарской палочкой (рис. 9.2, в). Оптимальная температура развития 40-42 °С. Предельная кислотность молока, сквашенного L. lactis, составляет 160-200 °Т. Используется в производстве сыров с высокой температурой второго нагревания.
Lactobacillus helveticus (швейцарская палочка). Палочки длиной 2-6 мкм, толщиной 1,0 — 1,5 мкм, располагаются одиночно или короткими цепочками (рис. 9.2, г). Оптимальная температура роста 42-45 °С. Молоко свертывает за 5-6 ч, предельная кислотность 300-350 °Т. Штаммы L. helveticus можно выделить из сычуга телят. Данный вид используется в заквасках для сыров с высокой температурой второго нагревания.
Lactobacillus casei subsp. rhamnosus (L. rhamnosus) имеет вид коротких или длинных палочек толщиной 1, 5 мкм, соединенных в цепочки (рис. 9.2, д). Часто обнаруживается зернистость клеток. Оптимальная температура роста около 30 °С. В отличие от L. casei способен расти при температуре 45 °С, размножаться в среде с содержанием 6 %-го NaCl и 20 %-й желчи. По сравнению с мезофильными лактококками протеолитическая активность L. rhamnosus в 2 раза выше. Предельная кислотность в молоке 80-180 °Т. Используется в заквасках для производства сыров: эмментальского, эдам, честер и других. Встречается в разных видах сыров в качестве сопутствующей микрофлоры.
Lactobacillus plantarum (L. plantarum). Палочки разной длины, соединенные в длинные и короткие цепочки (рис. 9.2, е). Оптимальная температура роста около 30 °С, предельная кислотность при развитии в молоке достигает 180 °Т. В молочной промышленности этот вид играет положительную роль при созревании сыров, так как может размножаться после сбраживания лактозы заквасочной микрофлорой и при концентрации NaCl до 6 %. Кроме того, палочка плантарум образует пероксид водорода и синтезирует бактериоцин и плантарицин - вещества, подавляющие рост маслянокислых бактерий и кишечной микрофлоры, что предотвращает развитие пороков сыров - раннее и позднее вспучивание. L. plantarum используется также в составе заквасок для приготовления силоса, квашеной капусты.
Lactobacillus fermentum (L. fermentum) - толстые короткие палочки длиной 0,5-0,9 мкм (рис. 9.2, ж).
Lactobacillus brevis. (L. brevis). Мелкие палочки с закругленными концами размером 0,7-1,0 x 2-4 мкм (рис. 9.2, з).
Lactobacillus casei subsp. casei (L. casei) - палочки с прямоугольными концами размером 0,7-1,1 x 2-4 мкм, располагающиеся чаще всего цепочками (рис. 9.2, и). Оптимальная температура роста 28-32 °С, при температуре 45 °С рост прекращается.
Lactobacillus buchneri (L. buchneri) - палочки с закругленными концами, размером 0,7-1,0 x 2-4 мкм.
Палочки видов L. brevis, L. fermentum, L. buchneri относятся к группе облигатно гетероферментативных молочнокислых бактерий (бетабактерий). Они не свертывают молоко, однако при добавлении к нему дрожжевого автолизата образуют сгусток, предельная кислотность которого может достигать 150-160 °Т. Сбраживают глюкозу с образованием молочной кислоты, СО2, этанола и незначительного количества летучих кислот. Образуют DL-изомеры молочной кислоты.
Бетабактерии участвуют в созревании сыров с низкой температурой второго нагревания, способствуя формированию рисунка и запаха сыра. Они также встречаются в строме кефирного грибка.
9.2. Бифидобактерии
Бифидобактерии включены в семейство Actinomycetaceae, род Bifidobacterium. Являются представителями нормальной микрофлоры кишечника человека и животных. Обладают высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным и условнопатогенным микроорганизмам.
Морфология. Форма клеток - мелкие, иногда ветвящиеся палочки Y- или V- формы, прямые или изогнутые, булавовидные или лопатовидные (рис. 9.3). Микробные клетки располагаются одиночно, парами, палисадом, розетками, редко - цепочками. Размеры клеток 0,5-1,3 х 1,5-8 мкм. Бифидобактерии положительно красятся по Граму, не образуют эндоспор, неподвижны. Некоторые штаммы способны образовывать микрокапсулу.
Рис. 9.3. Бифидобактерии
Бифидобактерии - строгие анаэробы. Оптимальная температура их роста 36-40 °С, температурные пределы роста 20-50 °С. Оптимальное значение рН среды 6-7, при рН ниже 4,5 рост бифидобактерий приостанавливается. При сбраживании углеводов бифидобактерии образуют молочную и уксусную кислоты в соотношении 2:3. В коровьем молоке бифидобактерии размножаются медленно, поскольку оно не является естественной средой их обитания. Для культивирования бифидобактерий в лабораторных условиях используют печеночно-цистеиновую среду Блаурока или гидролизатно-молочную среду (ГМС). После лабораторного культивирования они способны свертывать молоко через 10-12 ч. Предельная кислотность молока достигает 120-130 °Т.
Штаммы бифидобактерий используют для производства детских, лечебных и диетических кисломолочных продуктов (биойогурта, бифилакта, бифидокефира, ацидобифилина и др.).
9.3. Пропионовокислые бактерии
Пропионовокислые бактерии относят к семейству Propionibacteriaceae, роду Propionibacterium. Типовой вид этого рода - Propionibacterium freudenreichii.
Propionibacterium freudenreichii - мелкие, неподвижные, неспорообразующие, грамположительные полиморфные палочки размером 0,5-0,8 х 1-5 мкм. Клетки бывают кокковидными, удлиненными, раздвоенными или разветвленными (встречаются булавовидные формы); располагаются одиночно, парами, в виде букв V или Y (рис. 9.4).
Рис. 9.4. Propionibacteriun freudenreichii
По отношению к кислороду воздуха - факультативные анаэробы. Максимальный рост наблюдается при оптимальной температуре 30-37 °С и значении рН около 7,0.
В молоке пропионовокислые бактерии развиваются медленно и свертывают его через 5-7 дней. Предельная кислотность молока может достигать 160-170 °Т.
Пропионовокислые бактерии используют в сыроделии при производстве сыров с высокой температурой второго нагревания. После окончания молочнокислого брожения в сырах начинается стадия развития пропионовокислых бактерий. Последние в ходе пропионовокислого брожения накапливают пропионовую и уксусную кислоты и диоксид углерода. Летучие кислоты придают сырам специфический вкус и запах, а диоксид углерода формирует рисунок сыра.
9.4. Уксуснокислые бактерии
Уксуснокислые бактерии (ацетобактерии) относят к роду Асеtobacter, включающему семь видов. Типовой вид - Асеtobacter aceti. Acetobacter aceti - мелкие, прямые или изогнутые палочки размером 0,6-0,8 x 1,0-3,0 мкм. Встречаются также нитевидные, эллипсовидные или имеющие вздутия формы клеток. Располагаются одиночно или цепочками (рис. 9.5). Грамотрицательные, подвижные за счет перитрихиально или латерально расположенных жгутиков, эндоспор и капсул не образуют.
Рис. 9.5. Бактерии вида Acetobacter aceti
По отношению к кислороду воздуха эти бактерии являются облигатными аэробами. По типу питания они хемоорганотрофы. Окисляют этанол до уксусной кислоты, лактат и ацетат - до СО2 и Н2O. Наилучшими источниками углерода для роста служат этанол, глицерол и лактат; лактозу и крахмал не гидролизуют.
Колонии бактерий вырастают только на поверхности питательной среды, на жидких питательных средах они образуют пленку. В молоке развиваются плохо и кислоты не образуют.
Оптимальная температура развития 30 °С, оптимум рН 5,4-6,3. Уксуснокислые бактерии входят в состав кефирных грибков, играя положительную роль в симбиозе входящих в него микроорганизмов. Однако их присутствие в сметане, твороге, простоквашах может вызвать нежелательный запах, привкус уксусной кислоты и ослизнение продукта.
Задание по теме:
1. Приготовить фиксированные окрашенные препараты разных видов молочнокислых бактерий, рассмотреть их под микроскопом с объективом 90х и зарисовать микроскопическую картину.
2. Приготовить фиксированный окрашенный препарат чистой культуры бифидобактерий, рассмотреть его под микросокопом с объективом 90х и зарисовать микроскопическую картину.
3. Рассмотреть готовые препараты пропионовокислых и уксуснокислых бактерий и зарисовать их микроскопическую картину.
Контрольные вопросы
1. На какие группы подразделяют молочнокислые палочки по типу сбраживания углеводов?
2. Как молочнокислые бактерии относятся к кислороду воздуха?
3. Каким способом молочнокислые бактерии получают энергию?
4. Какие продукты метаболизма образуются при гомо- и гетероферментативном молочнокислом брожении?
5. Какие бактериоцины синтезируют молочнокислые бактерии?
6. Охарактеризуйте морфологию бифидобактерий.
7. Дайте характеристику морфологии бифидобактерий.
8. В каких молочных продуктах используются пропионовокислые бактерии?
9. Какова роль уксуснокислых бактерий в молочных продуктах?