ОБЩАЯ И ПИЩЕВАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ЧАСТЬ II - Л. В. Красникова - 2016
ТЕМА 12. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ПИВОВАРЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА
12.1. Посторонние микроорганизмы в пивоварении
В пивном сусле и пиве способны размножаться лишь определенные виды микроорганизмов, приспособившиеся к специфическим условиям пивоваренного производства. Основными контаминантами засевных дрожжей, сусла и пива являются: грамположительные бактерии родов Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Micrococcus, Sarcina, Streptococcus, Kocuriaи грамотрицательные бактерии родов Acetobacter, Zymomonas, Citrobacter, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Obesumbacterium. Кроме бактерий вредителями пивоваренного производства являются дикие дрожжи (их подробная характеристика дана в учебном пособии «Общая и пищевая микробиология», 2016, часть I).
Бактерии рода Lactobacillus попадают в пиво с суслом, засевными дрожжами, недостаточно чистой водой. Наиболее часто в пиве встречаются лактобациллы видов L. brevis(толерантный к хмелю), L. diastaticus (обладающий активными амилазами и ответственный за гидролиз декстринов в пиве), а также L. casei, L. plantarum, L. fermentum, L. coryneformis, L. buchneri.
Порча пива, вызываемая лактобациллами, характеризуется появлением «шелковистого помутнения», иногда перед этим появляется маслянистый запах диацетила. Образующаяся при брожении молочная кислота придает пиву кислый вкус.
Молочнокислые бактерии рода Pediococcus (ранее их называли пивными сарцинами из-за расположения кокков в виде тетрад) образуют в пиве опалесцирующую муть, мелкозернистый осадок, неприятный вкус и медовый запах. Среди педиококков в пиве доминирует вид Pediococcus damnosus, который наиболее стоек к антисептическому действию хмеля. В результате размножения педиококков может увеличиться вязкость пива, при этом за образование слизи ответственны педиококки вида P. acidilactici, образующие сложные внеклеточные гетерополисахариды, в состав которых входят глюкоза, манноза и нуклеиновая кислота.
Гетероферментативные молочнокислые бактерии рода Leuconostoc редко встречаются на пивоваренных предприятиях. Выделенный из пива вид Leuc. mesenteroides способен вызывать ослизнение пива за счет биосинтеза полисахарида декстрана.
Бактерии родов Micrococcus, Sarcina, Streptococcus, Kocuria широко распространены на пивоваренных предприятиях и в отдельных случаях могут привести к порче пива. Многие виды этих микроорганизмов способны выживать в пиве в течение длительного времени.
Некоторые виды микрококков, обнаруживаемые в пивоварении, относят к роду Kocuria. В частности, Kocuria kristinae - анаэробный грамположительный микрококк, характеризующийся кислото- и хмелеустойчивостью. Некоторые штаммы этого вида микрококков в анаэробных условиях могут привести к появлению фруктового аромата и неспецифического вкуса пива.
Уксуснокислые бактерии традиционно подразделяют на роды Acetobacter и Gluconobacter. Это важная группа грамотрицательных палочек, способных в аэробных условиях окислять спирт в уксусную кислоту. Они попадают в пиво из сусла с засевными дрожжами. Acetobacter aceti и Gluconobacter oxydans характеризуются стойкостью к антисептическому действию хмеля, толерантны к этиловому спирту и кислой среде. Уксуснокислые бактерии портят пиво, придавая ему кислый вкус, посторонние привкусы и ароматы, вызывают появление мути и образование слизи.
Род Zymomonas. В род Zymomonas входит лишь один вид - Zymomonas mobilis. Клетки бактерий этого вида представляют собой короткие толстые палочки размером 1,0-1,4 х 2,0-6,0 мкм, грамотрицательные. Располагаются преимущественно парами, некоторые штаммы способны образовывать цепочки, розетки, у многих штаммов наблюдаются нитевидные (гифоподобные) клетки. Большинство штаммов неподвижны; клетки подвижных штаммов имеют от одного до четырех полярных жгутиков. Характерной особенностью бактерий рода Zymomonas является интенсивное сбраживание глюкозы и фруктозы по пути Энтнера-Дудорова с образованием спирта и диоксида углерода. Кроме того, в небольших количествах накапливаются уксусная и молочная кислоты, ацетальдегид, ацетон, глицерин. Около половины штаммов Zymomonas может размножаться при концентрации этанола в среде до 10 % об., а штамм Z. mobilis BS057 выдерживает концентрацию этанола 12-13 % об., которая достигается в процессе высокоплотного пивоварения. Пиво, контаминированное Zymomonas, имеет привкус гнилых яблок или фруктов.
Бактерии семейства Enterobacteriaceae. В данное семейство входит более 30 родов, из которых на пивоваренных предприятиях встречаются следующие: Citrobacter, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Obesumbacterium, Rhanella и Serratia.
Obesumbacterium proteus по своим свойствам близок к Hafnia alvei и, таким образом, входит в семейство Enterobacteriaceae. O. proteus часто обнаруживают в засевных дрожжах в виде коротких толстых палочек. Этот вид хорошо растет в охмеленном и неохмеленном сусле, толерантен к этанолу и может размножаться в широком диапазоне рН - от 4,4 до 9,0. В ходе брожения он размножается вместе с культурными дрожжами и тормозит процесс ферментации. В результате его жизнедеятельности в пиве возрастает содержание метилсульфида, диметилсульфида, n-пропанола, изобутанола, бутандиола и диацетила. Пиво, приготовленное с применением засевных дрожжей, контаминированных O. proteus, имеет побочный вкус и аромат пастернака и фруктов.
Rhanella aquatilis переименован из вида Enterobacter agglomerans. Его клетки имеют вид палочек размером 0,5-0,7 x 2,0-3,0 мкм. Подвижны при температуре 25 °С, но при 37 °С их подвижность снижается. Rhanella aquatilis сбраживает глюкозу с образованием кислоты и газа. Хорошо размножается в охмеленном и неохмеленном сусле и аккумулируется в повторно используемых дрожжах.
Пиво, контаминированное Rhanella aquatilis, содержит ненормально высокий уровень диацетила (до 0,7 мг/дм3) и диметилсульфида (до 143 мкг/дм3). Напиток имеет побочный фруктовый, молочный и сернистый вкус и аромат.
Кроме аэробных и факультативно анаэробных бактерий, вызывающих порчу пива, микробиологами пивоваренных производств были обнаружены и строго анаэробные бактерии: Pectinatus cerevisiiphilus и P. frisingensis, Selenomonas lacticifex, Zymophilus raffinovorans, Megasphaera cerevisiae.
Pectinatus cerevisüphilus. Клетки имеют вид слегка изогнутых палочек размером 0,7-0,9x3-30 мкм с закругленными концами. Подвижны за счет жгутиков, расположенных в виде гребешка на вогнутой стороне клетки. Грамотрицательны, эндоспор не образуют. Строгий анаэроб. Оптимальная температура роста около 30 °С. Сбраживает сахара с образованием уксусной, пропионовой и в небольших количествах молочной и янтарной кислот. Колонии на агаризованной среде круглые, плотные, белого или светло-бежевого цвета, блестящие, непрозрачные.
В пиве, контаминированном бактериями рода Pectinatus, содержится большое количество сероводорода, придающего напитку запах тухлых яиц.
Selenomonas lacticifex. Клетки штаммов этого вида представляют собой изогнутые палочки размером 0,9-1,1 x 3,0-6,0 мкм, часто с зауженными концами, располагаются парами или короткими цепочками. Обладают подвижностью кувыркательного типа за счет наличия жгутиков (до 16 шт.), расположенных в виде пучка на вогнутой стороне клетки. Грамотрицательны, не образуют эндоспор. Строгие анаэробы. Глюкозу сбраживают с образованием уксусной и пропионовой кислот, диоксида углерода и/или молочной кислоты. Колонии, выросшие на модифицированном MRS-агаре, округлой формы, диаметром 2-3 мм, гладкие, непрозрачные, желтоватого цвета.
Zymophilus raffinovorans. Клетки этого микроорганизма имеют вид прямых или слегка изогнутых грамотрицательных палочек размером 0,7-0,9x3,0-15 мкм. Подвижны, хотя в процессе нескольких пассажей подвижность может быть утрачена. Строгий анаэроб. На среде MRS вырастают округлые, гладкие непрозрачные колонии размером 1-2 мм, желтоватого цвета. Глюкозу сбраживают с образованием уксусной и пропионовой кислот, иногда молочной в следовых количествах.
Megasphaera cerevisiae. Клетки данного вида имеют вид удлиненных кокков диаметром 1,3-1,6 мкм, располагаются парами или иногда в цепочках. Грамотрицательные, неподвижные, не образуют эндоспор. Строгие анаэробы, каталазо- и оксидазоотрицательные. Оптимальная температура роста 28 °С. В пиве штаммы Megasphaera продуцируют значительное количество масляной кислоты, в меньших количествах уксусную, изовалериановую, валериановую, копроновую кислоты и ацетоин. При контаминации пива бактериями рода Megasphaera в нем появляются неприятный запах и помутнение. Штаммы Megasphaera cerevisiae чувствительны к этиловому спирту, поэтому они встречаются преимущественно в слабоалкогольном непастеризованном пиве.
12.2. Контроль качества засевных дрожжей
Основными показателями качества засевных дрожжей являются морфологическое состояние клеток, биологическая чистота и физиологические свойства.
Отбор пробы. Пробу промытых, хорошо размешанных засевных дрожжей отбирают в стерильную колбочку чистой стеклянной трубочкой, опуская ее до дна ванночки. Колбочку сразу же закрывают ватной пробкой и подписывают штамм дрожжей и их генерацию.
Морфологическое состояние клеток определяют путем микро- скопирования. Клетки должны быть одинакового размера, иметь тонкую оболочку, однородную или мелкозернистую цитоплазму с небольшими вакуолями. Наличие значительного количества морфологически измененных клеток, особенно в сочетании с пониженной бродильной активностью, свидетельствует о дегенерации культуры дрожжей. Если в препарате отсутствуют почкующиеся клетки, дрожжи имеют зернистую цитоплазму, крупные вакуоли, то это свидетельствует о том, что культура старая.
Определение биологической чистоты дрожжей. На предметное стекло наносят каплю 10 %-го раствора KOH или 50 %-й уксусной кислоты и вносят в нее каплю исследуемой дрожжевой суспензии. Это способствует расщеплению белков и жировых частиц и облегчает просмотр препарата. В поле зрения должно быть не более 50 клеток. Просматривают около 20 полей зрения, среди культурных дрожжей отмечают отличающиеся от них клетки диких дрожжей и бактерии (палочки, кокки, педиококки). Пригодными для производства считают засевные дрожжи, содержащие не более 0,5 % диких дрожжей и не более 1 % бактерий.
Количество бактерий в засевных дрожжах можно определить чашечным методом путем посева соответствующих разведений (10-1; 10-2; 10-3 и т. д.) на сусло-агар, дрожжевой агар, содержащий 1 % глюкозы, 1 % мела и антибиотик (нистатин или актидион).
Для обнаружения диких дрожжей используют питательные среды, содержащие вещества, ингибирующие рост культурных дрожжей. Дикие дрожжи, относящиеся к роду Saccharomyces,высевают на среду с кристаллвиолетом. Дикие дрожжи, не относящиеся к роду Saccharomyces, определяют посевом разведений на синтетическую среду с лизином.
Физиологическое состояние дрожжей определяют по содержанию в них гликогена. Одну каплю суспензии дрожжей наносят на предметное стекло, вносят в нее раствор йода и накрывают сверху покровным стеклом. Через 5-6 мин препарат рассматривают под микроскопом. В упитанных дрожжах 70-75 % клеток содержат гликоген. Если в препарате обнаруживается меньшее количество клеток с гликогеном, то это свидетельствет об их старости, длительном хранении под слоем воды в ванночках или о недостаточно хорошем питании.
Определение конечной степени сбраживания. Сусло разливают в колбы, стерилизуют, охлаждают и определяют в нем исходное содержание сухих веществ. Затем в колбы в зависимости от их объема вносят по 10 % хорошо отпрессованных дрожжей и тщательно взбалтывают. Колбы помещают в термостат с температурой 25±1°С на двое суток, после чего снова определяют содержание СВ.
Конечную степень сбраживания определяют по формуле
υ = [(Р-P1) х 100] / Р,
где υ - конечная степень сбраживания; Р - начальное содержание СВ в сусле, %; Р1 - конечное содержание СВ после брожения, %.
Конечную степень сбраживания в засевных дрожжах определяют дважды в месяц, особенно при использовании нового сырья.
12.3. Определение качества готового пива
В готовом пиве определяют общее количество микроорганизмов, БГКП и его биологическую стойкость в товарной упаковке.
Определение БГКП в пиве проводят бродильным методом не реже одного раза в месяц путем посева в питательную среду или методом мембранных фильтров.
Бродильный метод. Пиво перед исследованием нейтрализуют стерильным 10 %-м раствором натрия двууглекислого до рН 7,2-7,4. По 1 см3 пива засевают в три пробирки с 9 см3среды Кесслера. Посевы помещают в термостат с температурой 37±0,5 °С на 24 ч. Если нет признаков роста, дают заключение об отсутствии в исследуемом пиве БГКП. При наличии газа в поплавках в среде Кесслера необходимо сделать штрихом высев материала из забродивших пробирок на поверхность среды Эндо в чашке Петри. Чашки помещают в термостат с температурой 37±0,5 °С на 24 ч. Из выросших на среде Эндо типичных колоний (темно-красных с металлическим блеском или без него) готовят фиксированные препараты и окрашивают их по Граму. Присутствие в препарате мелких грамотрицательных палочек свидетельствует о наличии в пиве БГКП.
Метод мембранных фильтров. Для проведения исследования выбирают фильтры, размеры пор которых позволяют осадить на них основное количество микроорганизмов (диаметр пор 0,45 нм). Из каждой отобранной для анализа упаковки 100 см3 пропускают через предварительно простерилизованный мембранный фильтр. По окончании фильтрации фильтр промывают стерильной водой, затем фламбированным пинцетом осторожно помещают на поверхность среды Эндо в чашке Петри. После инкубации при температуре 37±0,5 °С в течение 24 ч отмечают рост характерных колоний БГКП или их отсутствие.
Биологическую стойкость пива определяют по времени его помутнения. Для этого отбирают по две бутылки пива от каждого разлитого сорта и помещают в термостат с температурой 20 °С. Ежедневно бутылки просматривают и отмечают время (в сутках) помутнения пива, выпадения осадка, появления пленки и других признаков порчи. В случае появления помутнения раньше срока, предусмотренного стандартом, осадок или пленку микроскопируют с целью установления группы микроорганизмов, вызвавших порчу пива.
Задание по теме:
1. Определить морфологическое состояние клеток засевных дрожжей.
2. Определеить биологическую чистоту засевных дрожжей.
3. Определить конечную степень сбраживания засевных дрожжей.
4. Ознакомиться с определением БГКП в пиве методом мембранных фильтров.
Контрольные вопросы
1. Какие микроорганизмы являются вредителями пивоваренного производства? Как они влияют на качество пива?
2. Как определяют качество засевных дрожжей по морфологическому состоянию клеток?
3. Как определяют конечную степень сбраживания сусла дрожжами?
4. Как определяют биологическую стойкость пива?
5. Какими методами определяют БГКП в пиве?