ОБЩАЯ И ПИЩЕВАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ЧАСТЬ II - Л. В. Красникова - 2016

ТЕМА 1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СВЕЖЕГО МЯСА

1.1. Микрофлора свежего мяса

На мясоперерабатывающих предприятиях микробиологическое исследование мяса и мясных продуктов проводят с профилактической целью или как вынужденное, когда требуется выявить в мясе присутствие патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, а также при подозрении на нарушения в ходе технологического процесса. Микробиологическому исследованию подвергают сырье, готовые изделия, а также тару, инвентарь, руки рабочих, непосредственно связанных с мясной продукцией.

Мясо является полноценной питательной средой для жизнедеятельности многих микроорганизмов. Высокие значения активности воды (a_w - 0,98-0,99) и рН (от 5,5 до 6,5) также благоприятны для размножения микроорганизмов в свежем мясе.

Микроорганизмы, как правило, не содержатся в крови, мышечной ткани и во внутренних органах здоровых животных, организм которых обладает высокой сопротивляемостью к их проникновению. Существуют два пути контаминации органов и тканей животных микроорганизмами: эндогенный и экзогенный.

Эндогенная контаминация мяса микробами наблюдается у животных, больных инфекционными болезнями, что представляет большую опасность для человека, а также у ослабленных и утомленных животных. У животных, убитых в стадии резкого утомления, микроорганизмы содержатся практически во всех органах и тканях.

Экзогенная контаминация мяса и органов микроорганизмами происходит после убоя в процессе последующих операций (снятие шкуры, разделка и нутровка туши) и в ходе заключительной обработки мяса.

Микрофлора парного мяса здоровых животных представлена ограниченным количеством микроорганизмов, но достаточно разнообразна по видовому составу. Бактерии, часто встречающиеся на свежем мясе, относятся к родам Pseudomonas, Acineto- bacter/Moraxella, Clostridium, Aeromonas, Psychrobacter, Enterobacteriaceae, Micrococcaceae, Bacillus, Shewanella, Brochotrix, Lactobacillus, Carnobacterium, Leuconostoc, Weissella. На 1 см² поверхности мяса может насчитываться от 10³ до 10⁵ клеток микроорганизмов. Доминирующими являются неспорообразующие, грамотрицательные палочки - псевдомонады, флавобактерии, аэромонады, колиформные бактерии, палочки протея. Среди грамположительных бактерий чаще обнаруживаются молочнокислые, в значительно меньших количествах - аэробные и анаэробные спорообразующие бактерии, а также дрожжи родов Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Torulopsis, споры плесневых грибов. Многие из названных микроорганизмов обладают активными протеазами и липазами, катализирующими гидролиз белков и липидов мяса.

Характерно, что из большого количества микроорганизмов - контаминантов свежего мяса - активно размножаются лишь некоторые виды, которые становятся доминирующими и составляют «ассоциацию микроорганизмов порчи». Видовой состав ассоциации зависит от типа взаимоотношений, внутренних и внешних факторов, технологических параметров переработки мяса.

Мясо может быть контаминировано и токсикогенными микроорганизмами, например, Clostridium perfringens, Salmonella typhimurium, Bacillus cereus, энтерококками. При значительном размножении этих бактерий мясо может послужить причиной пищевых отравлений.

Бактериологическое исследование мяса и мясопродуктов проводится для предупреждения:

✵ заражения рабочих, занимающихся убоем скота и переработкой мяса;

✵ допуска в пищу мяса и мясопродуктов, полученных от животных, имевших инфекционные заболевания;

✵ выпуска в реализацию продуктов, употребление которых может вызвать у людей пищевые токсикоинфекции или токсикозы, а также распространение инфекций.

Микробиологические анализы осуществляют в бактериологической лаборатории предприятия в соответствии с действующими ГОСТами или нормативно-технической документацией. Микробиологическое исследование свежего мяса начинают с микроскопического исследования мазков-отпечатков (бактериоскопический метод), а затем проводят бактериологический анализ.

1.2. Бактериоскопическое исследование мяса

Отбор проб. Для определения свежести мяса от каждой туши или полутуши отбирают для исследования три образца массой не менее 200 г каждый целым куском из мышц бедра, лопатки и области 4-5 шейных позвонков. В образцах, кроме мышечной ткани, должны быть сухожилия и жир.

Для бактериологического исследования на сибирскую язву направляют лимфатический узел, собирающий лимфу с места локализации пораженного очага, отечную ткань, а у свиней, кроме того - подчелюстной лимфатический узел.

Для исследования на листериоз направляют головной мозг, долю печени и почку.

При исследовании полутуши и четверти туши берут кусок мышцы, лимфатические узлы и трубчатую кость.

Каждый образец упаковывают отдельно в пергаментную бумагу, ставят дату, место взятия проб, вид животного, номер туши, причину и цель исследования и отправляют в лабораторию.

Бактериоскопический метод - совокупность способов обнаружения и изучения морфологических и тинкториальных свойств бактерий (микробов) в лабораторных условиях. В лабораторной практике используют следующие типы микроскопических препаратов: препарат-отпечаток, висячую каплю, раздавленную каплю, тонкий мазок, фиксированный окрашенный препарат.

Бактериоскопическое исследование мяса проводят в случае расхождения результатов между биохимическими и органолептическими методами оценки. Необходимость в бактериоскопическом исследовании свежести мяса отпадает в случае отрицательного результата при органолептическом анализе.

Из каждой пробы мяса необходимо приготовить не менее двух мазков-отпечатков.

Для приготовления мазка-отпечатка из поверхностного слоя (на глубине 2-3 см) стерильными ножницами или скальпелем вырезают кусочек мяса массой 2-3 г, прикладывают его внутренней срезанной стороной к предварительно профламбированной поверхности предметного стекла.

Для приготовления мазков-отпечатков из глубоких слоев поверхность пробы мяса необходимо сначала простерилизовать (смочить спиртом и обжечь на пламени или прижечь нагретым металлическим шпателем). Затем стерильным инструментом вырезать из глубины небольшие кусочки мяса размером 2 x 1,5 x 2,5 см и сделать мазки-отпечатки.

Приготовленные на предметных стеклах мазки-отпечатки необходимо высушить на воздухе, зафиксировать в пламени горелки или спиртовки и окрасить по методу Грама. Каждый мазок-отпечаток просмотреть под микроскопом с иммерсионным объективом не менее чем в 25 разных полях зрения.

При микроскопировании подсчитывают отдельно число клеток бактерий (кокков и палочек) и дрожжей в каждом просмотренном поле зрения, результатом является среднее значение общего количества клеток по двадцати пяти полям зрения. Отмечают также наличие или отсутствие следов распада мышечной ткани в поле зрения микроскопа. Результаты микроскопирования оценивают в соответствии с данными, представленными в табл. 1.1.

Таблица 1.1. Оценка результатов бактериоскопического анализа мяса

Примечание. При обнаружении в мазках-отпечатках грамположительных палочек с обрубленными концами последние окрашивают 2 %-м раствором сафранина. Наличие в мазках, окрашенных сафранином, палочек или цепочек с капсулами свидетельствует о присутствии возбудителя сибирской язвы.

1.3. Бактериологическое исследование мяса

При отсутствии в мазках-отпечатках бактерий, похожих на сибиреязвенные, из образцов мяса и субпродуктов проводят посевы на питательные среды для выявления в них возбудителей пищевых токсикоинфекций (бактерий родов Escherichia, Proteus, Salmonella), возбудителей зооантропонозов (бацилл сибирской язвы, бактерий листериоза, рожи свиней и др.) и анаэробов (патогенных и токсикогенных клостридий).

При бактериологическом исследовании каждую пробу освобождают от жировой и соединительной тканей, погружают в спирт, затем вырезают стерильными ножницами из глубины различных мест кусочки размером 2,0 х 1,5 x 2,5 см. Затем все вырезанные кусочки измельчают стерильными ножницами. Для посева составляют пробы по 15 г. Одна проба состоит из кусочков мышц и лимфатических узлов, а другая - из кусочков паренхиматозных органов. Из каждой пробы готовят в стерильной ступке взвесь с содержанием в 1 см³ 0,5 г продукта.

1.3.1. Определение общего количества микроорганизмов (КМАФАнМ)

Общее количество микробов - это количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) в 1 г продукта. Метод определения основан на способности мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов размножаться на плотном питательном агаре при температуре 37±1 °С в течение 72 ч. Количество засеваемого продукта устанавливают с учетом наиболее вероятного микробного обсеменения. При исследовании свежего мяса в питательную среду засевают разведения от 10^-1 до 10^-3.

Для посева 0,1 г продукта (разведение 10^-1) готовят первое десятикратное разведение взвеси: стерильной пипеткой набирают 1 см³ взвеси, переносят её в пробирку с 9 см стерильного физиологического раствора (1 см полученного раствора содержит 0,1 г продукта).

Для посева 0,01 г продукта (разведение 10^-2) готовят второе десятикратное разведение: стерильной пипеткой перемешивают содержимое пробирки с первым разведением, набирают 1 см³ и переносят в пробирку с 9 см³ стерильного физиологического раствора (1 см³ полученного раствора содержит 0,01 г продукта).

Для посева 0,001 г продукта (разведение 10^-3) готовят третье десятикратное разведение: стерильной пипеткой перемешивают содержимое пробирки со вторым разведением, набирают 1 см³ и переносят в пробирку с 9 см³ стерильного физиологического раствора (1 см³ полученного раствора содержит 0,001г продукта).

По 1 см³ каждого разведения засевают в чашки Петри с заранее маркированной крышкой и заливают 10 — 15 см³ расплавленного и остуженного до температуры 40 — 45 °С мясопептонного агара (МПА). Сразу после заливки агара содержимое чашек Петри тщательно перемешивают путем легкого покачивания для равномерного распределения посевного материала. После застывания агара чашки Петри переворачивают крышками вниз и ставят в таком виде на 72 ч в термостат с температурой 37 °С.

По окончании культивирования подсчитывают количество выросших на чашках с МПА колоний. При этом используют лупу с увеличением в 4 — 10 раз или пользуются специальным прибором для подсчета колоний. При большом числе колоний и их равномерном распределении в агаре на дно чашки Петри наносят четыре или более одинаковых секторов, подсчитывают число колоний в двух-трех секторах (но не менее чем на 1/3 поверхности чашки), находят среднее арифметическое число колоний и умножают на общее количество секторов всей чашки.

Количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов в 1 см3 свежего мяса (X) вычисляют по формуле

X = n x 10^m,

где n - среднеарифметическое число колоний, подсчитанных на чашках Петри с разными разведениями продукта; m - число десятикратных разведений.

1.3.2. Определение бактерий группы кишечной палочки (БГКП)

В настоящее время к БГКП относят следующие роды из семейства Enterobacteriaceae: Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Serratia.

БГКП представляют собой мелкие, неспорообразующие палочки, которые располагаются одиночно, грамотрицательные, подвижные - перитрихи (исключение составляют бактерии рода Klebsiella, не имеющие жгутиков), не образуют спор и капсул (кроме бактерий рода Klebsiella, клетки которых окружены капсулой), факультативные анаэробы. Представители этого семейства имеют каталазу и цитохромы, могут получать энергию как в процессе дыхания, так и в процессе брожения. Осуществляют муравьинокислое брожение с накоплением СО₂ и Н₂О и кислот (уксусной, молочной, янтарной).

Метод определения БГКП основан на обнаружении образования газа или кислоты в элективной питательной среде, содержащей лактозу (среды Кесслера, Хейфеца, Кода). Метод учета БГКП получил название бродильного метода, сущность которого заключается в посеве определенного количества продукта или его разведений в жидкую питательную среду с последующим инкубированием при температуре 37 °С и обнаружении в поплавках газа с изменением цвета среды.

При обнаружении газа в пробирках на втором этапе исследования, производят пересев материала из забродивших пробирок на среду Эндо. Пересев делается бактериологической петлей густым штрихом для получения изолированной колонии. Чашки Петри с посевами инкубируют при температуре 37 °С в течение 24 ч, затем посевы просматривают. На среде Эндо БГКП вырастают, образуя яркокрасные блестящие колонии с металлическим блеском (или без него).

При отсутствии на среде Эндо характерных для БГКП яркокрасных колоний с металлическим блеском или без него дают отрицательный ответ на наличие кишечных палочек и исследование прекращают. При обнаружении на среде Эндо типичных для БГКП колоний устанавливается принадлежность выросших микроорганизмов к семейству кишечных бактерий. Для этого проводят тест на оксидазу (для БГКП она должна быть отрицательной). Затем из колоний, характерных для кишечных палочек, готовят фиксированный препарат, окрашивают его по Граму и микроскопируют. Под микроскопом должны обнаруживаться мелкие грамотрицательные палочки с закругленными концами. В этом случае ответ на присутствие БГКП в продукте считается положительным.

1.3.3. Обнаружение бактерий рода Proteus

Присутствие в свежем мясе бактерий рода Proteus в больших количествах свидетельствует о наличии гнилостного разложения мясных белков.

Бактерии рода Proteus также входят в семейство Enterobacteri- асеае и представляют собой полиморфные грамотрицательные палочки размером 0,4-0,8 x 1-3 мкм. Подвижные за счет перитрихиально расположенных жгутиков. Большинство штаммов обладает способностью к «роению» - распространению в виде однородной пленки по влажной поверхности агаризованной питательной среды. Бактериальная культура Proteus имеет специфический гнилостный запах.

Для обнаружения протея в мясе и мясопродуктах проводят посев по Шукевичу: соскоб с поверхности свежего разреза исследуемого образца вносят в конденсационную воду свежескошенного МПА в пробирках, не касаясь поверхности среды. Пробирки в вертикальном положении помещают на 18-24 ч в термостат с температурой 37 °С. Наличие на среде в пробирках вуалеобразного налета, при микроскопировании которого обнаруживают подвижные палочки, отрицательно окрашивающиеся по Граму, указывает на присутствие протея в исследуемых образцах.

Биохимические свойства видов бактерий рода Proteus приведены в табл. 1.2.

Таблица 1.2. Биохимические свойства бактерий рода Proteus

* кг - при сбраживании углеводов образуются кислота и газ; к - при сбраживании углеводов образуется кислота.

Следует отметить, что ранее входивший в эту группу вид Proteus rettgeri в настоящее время отнесен к роду Providencia.

При микробиологическом контроле проводят суммарное определение всех видов бактерий рода Proteus.

К общим свойствам бактерий рода Proteus относят положительные реакции с метиловым красным и Фогеса-Проскауэра, образование индола и сероводорода, способность расщеплять мочевину и неспособность сбраживать лактозу и маннит.

1.3.4. Выявление бактерий рода Salmonella

Бактерии рода Salmonella занимают первое место среди микроорганизмов, вызывающих пищевые отравления.

Род Salmonella входит в семейство Enterobacteriaceae. Сальмонеллы имеют вид мелких грамотрицательных палочек размером 0,7-1,5 x 2-5 мкм, обычно подвижных за счет перитрихиально расположенных жгутиков. Тип метаболизма - дыхательный и бродильный, они не содержат оксидазы, но имеют каталазу. Характерными признаками сальмонелл являются: положительная реакция с метиловым красным, отрицательная реакция Фогеса-Проскауэра, способность расщеплять цитраты и неспособность образовывать индол.

Для выявления сальмонелл навеску продукта массой 25 г объединенной пробы вносят во флакон, содержащий 100 см³ среды накопления (Кауфмана, Мюллера, Киллиана, хлористо-магниевой «М» или селенитового Ф-бульона), и помещают в термостат для культивирования при температуре 37 °С. На селенитовом Ф-бульоне оптимальная температура для накопления сальмонелл 43±1 °С. Через 16-24 ч делают посев из среды накопления на среду Эндо, Левина, Плоскирева или висмут-сульфитный агар (ВСА) (см. прил. п. п. 1.5-1.8), распределяя материал микробиологическим шпателем по поверхности среды. Посевы культивируют при температуре 37±1 °С в течение 20-24 ч. Сальмонеллы не ферментируют лактозу и дают типичный рост на селективно-дифференциальных средах:

✵ на среде Эндо сальмонеллы растут в виде круглых бесцветных или слегка розоватых прозрачных или полупрозрачных колоний;

✵ на среде Левина сальмонеллы образуют прозрачные, бледные, нежно-розовые или розовато-фиолетовые колонии;

✵ на среде Плоскирева колонии сальмонелл бесцветные, среда при обильном их росте желтеет;

✵ на висмут-сульфитном агаре сальмонеллы формируют черные или коричневые колонии с характерным металлическим блеском. При этом наблюдается прокрашивание в черный цвет участка среды под колонией.

При обнаружении на чашках подозрительных колоний из части колонии готовят фиксированный препарат, окрашивают по Граму и микроскопируют.

1.3.5. Выявление присутствия в мясе анаэробов

Исследование на анаэробные инфекции проводят на основании микроскопии мазков из мяса или патологического материала на питательные среды. При бактериоскопии мазков-отпечатков, окрашенных метиленовым синим или по Граму, обращают внимание на присутствие палочковидных грамположительных бактерий, наличие у них эндоспор и их расположение в клетке. Обнаружение в препаратах- отпечатках грамположительных толстых палочек с закругленными концами, палочек со спорами, имеющими вид пламени свечи или теннисной ракетки, указывает на возможность присутствия C. botulinum.

Для бактериологического исследования берут навеску мяса массой 10 г и растирают ее в ступке, добавляя двойное количество стерильного физиологического раствора для получения взвеси. На одну пробу необходимо четыре пробирки со средой Китта-Тароцци (см. прил., п. 1.1), которые предварительно прогревают (регенерируют) на кипящей водяной бане в течение 20-30 мин и быстро охлаждают до температуры 50 °С. В каждую пробирку засевают по 3-5 см3 приготовленной взвеси, после чего посевы в двух пробирках прогревают при температуре 80 °С в течение 30 мин для уничтожения вегетативной микрофлоры и выявления споровых форм анаэробов, а две другие не прогревают. Посевы помещают в термостат с температурой 37±1 °С на 5-10 сут.

При исследовании на присутствие возбудителей ботулизма типа Е (Clostridium botulinum) посев также делают в четыре пробирки со средой Китта-Тароцци, но перед термостатированием одну пробирку подогревают при температуре 80 °С в течение 30 мин, а другую - при температуре 60 °С в течение 15 мин (при этом сохраняются споры C. botulinum типа E). Две другие пробирки с посевами оставляют непрогретыми. Прогретые пробирки выдерживают в термостате с температурой 28±1 С, а две другие - в термостате с температурой 37±1 °С. Посевы просматривают ежедневно. Рост C. botulinum характеризуется газообразованием и помутнением среды. При обнаружении роста производят микроскопию мазков, окрашенных про Граму.

Микробиологические показатели мяса и мясных полуфабрикатов приведены в табл. 1.3.

Таблица 1.3. Микробиологические показатели мяса и мясных полуфабрикатов (ТР ТС 034/2013)

Задание по теме:

1. Провести бактериоскопический анализ свежего мяса. Сделать заключение о свежести исследованных проб мяса.

2. Провести бактериологический анализ свежего мяса. Сделать посевы на питательные среды для определения общего количества микробов (КМАФАнМ), бактерий группы кишечной палочки (БГКП), бактерий рода Proteus по методу Шукевича.

3. Ознакомиться с методами выявления в мясе бактерий родов Salmonella и Clostridium.

Контрольные вопросы

1. Какие микробиологические методы используют для определения доброкачественности мяса?

2. В каком случае проводят бактериоскопический анализ мяса и мясопродуктов?

3. В чем заключается бактериологический анализ мяса?

4. Какие группы микроорганизмов определяют в свежем мясе?

5. Каков характер роста сальмонелл на средах Эндо, Левина, Плоскирева, висмут-сульфитном агаре?

6. В каких случаях необходимо проверять в мясе наличие анаэробных бактерий?