ОБЩАЯ И ПИЩЕВАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ЧАСТЬ II - Л. В. Красникова - 2016

ТЕМА 7. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЯИЦ И ЯЙЦЕПРОДУКТОВ

7.1. Микрофлора яиц в скорлупе

Яйца птицы по своему составу являются хорошим субстратом для размножения различных групп микроорганизмов и относятся к скоропортящимся продуктам. В связи с этим яйца необходимо хранить в условиях, которые обеспечивали бы замедленное протекание в них физико-химических и микробиологических процессов.

Скорлупа защищает яйца от проникновения микроорганизмов. Составляющие яйца обладают разной степенью устойчивости к микробам. Более устойчив к разложению белок, что объясняется содержанием в нем бактерицидных веществ: лизоцима, овидина, кональбумина, овомукоида, овомуцина и диоксида углерода. Микроорганизмы могут попадать в яйца как эндогенным, так и экзогенным путем.

Эндогенная контаминация появляется при заболевании птиц туберкулезом, сальмонеллезом, возбудители которых проникают из яичника или яйцевода внутрь яйца. Яйца водоплавающей птицы особенно опасны в отношении заболевания сальмонеллезом; в их яйцеводе часто обнаруживаются бактерии паратифозной группы: Salmonella. pullorum, S. gallinarium, S. enteritidis, S. dublin, S. newport, S. typhimurium, S. livingstone и др. Поэтому реализация утиных и гусиных яиц и их использование на предприятиях общественного питания запрещены.

Экзогенная контаминация поверхности яиц происходит уже после кладки. Основными источниками микроорганизмов являются помет, почва, перья. Степень обсемененности яиц микроорганизмами зависит от условий содержания птицы. В частности, незагрязненные яйца содержат на 1 см² поверхности не более 10¹-10² микроорганизмов, тогда как на загрязненных яйцах количество микроорганизмов может достигать 10⁵-10⁶. Состав поверхностной микрофлоры яиц весьма разнообразен. Чаще всего обнаруживаются БГКП, протеи, псевдомонады, аэробные спорообразующие палочки, микрококки, споры мицелиальных грибов. Эти микроорганизмы попадают на яйцо, в основном, при прохождении его через клоаку.

Яйца птицы могут быть контаминированы и патогенными микроорганизмами. Через яйца и яичные продукты передаются возбудители сальмонеллеза, птичьего туберкулеза, кокковых интоксикаций, кампилобактериоза, псевдомоноза.

Яйца с загрязненной поверхностью не допускаются к реализации, их необходимо мыть. Скорость проникновения микроорганизмов в яйца зависит от их свежести, температуры и влажности воздуха, вида микроорганизмов. Нарушение температурно-влажностного режима хранения яиц приводит к тому, что микрофлора с поверхности яйца через поры проникает внутрь вначале на подскорлупные оболочки, а затем в белок и желток. Защитные факторы бактерицидности инактивируются, что приводит к порче яиц. Основными видами порчи яиц являются гниение и плесневение.

Гниение чаще всего вызывают грамотрицательные неспорообразующие бактерии родов Pseudomonas, Proteus, Aeromonas, Enterobacter, Serratia, Escherichia, Acinetobacter/Moraxella и некоторые другие. В результате размножения флюоресцирующих псевдомонад (Pseudomonas fluorescens) белок яйца становится мутным, разжиженным и в дальнейшем приобретает зеленоватый оттенок, переходящий в темно-зеленый цвет (зеленая гниль). При попадании внутрь яйца других видов бактерий с высокой протеолитической активностью, таких как Aeromonas, Proteus, Escherichia, белок яйца разжижается, а желток становится черным (черная гниль). Из-за накопления газов, образуемых гнилостными бактериями, скорлупа разрывается и содержимое яйца освобождается, издавая тухлый запах. Размножение в яйце гнилостных аэробных грамположительных бацилл (Bacillus subtilis, B. mycoides и др.) приводит к тому, что оболочка желтка разрушается, желток соединяется с белком, образуя мутную жидкую массу. При овоскопии такие яйца не просвечиваются, и этот вид порчи получил название «тумак бактериальный». Бактерии, образующие красный или розовый пигмент (Serratia marcescens, Micrococcus roseus), и некоторые дрожжи вызывают окрашивание содержимого яйца в розовый цвет (розовая гниль). Смешанную гниль вызывают БГКП, аэробные бациллы, протеи, псевдомонады и другие микроорганизмы, обладающие активными протеазами. В этом случае белок яйца разжижается, становится серым, приобретает гнилостный запах.

Плесневение. Хранение яиц в помещениях с высокой влажностью приводит к развитию на их поверхности плесени. Чаще всего плесневение яиц вызывают грибы родов Penicillium, Cladosporium, Sporotrichum. Грибы рода Penicillium образуют точечные пятна желтого, зеленого или голубого цвета; Cladosporium - пятна темнозеленого и черного цвета; Sporotrichum- пятна красного и розового цвета. Мицелиальные грибы размножаются на подскорлупной оболочке и около воздушной камеры. Начальная стадия размножения плесеней характеризуется образованием темного пятна, видимого при овоскопии. В дальнейшем мицелий гриба разрастается, размеры пятна увеличиваются, белок и желток смешиваются, и яйцо полностью утрачивает прозрачность. Такой вид порчи яиц называют «тумак плесневелый».

7.2. Микрофлора меланжа и яичного порошка

Меланж представляет собой смесь яичного белка и желтка в естественной пропорции, хорошо размешанную, освобожденную от скорлупы и замораженную в специальной таре. Для приготовления меланжа используют яйца только I категории. Нельзя использовать утиные, гусиные и известкованные куриные яйца, а также яйца, поступающие от предприятий, неблагополучных по инфекционным заболеваниям птиц.

Меланж - это скоропортящийся продукт, поэтому при его производстве необходимо строго соблюдать санитарно-гигиенические условия и после оттаивания перерабатывать в течение 2-3 ч.

Микрофлора меланжа представлена микрококками, сарцинами, протеями, псевдомонадами, колиформными бактериями, аэробными бациллами, спорами плесневых грибов. Иногда в меланже присутствуют патогенные микроорганизмы - сальмонеллы и золотистый стафилококк. Кроме сальмонелл, большую обеспокоенность может вызывать контаминация яиц такими психротрофными патогенными микроорганизмами, как Listeria monocytogenes и Yersinia enterocolitica. Они могут размножаться при температуре 3-5 °С как в сыром, так и в пастеризованном меланже. Присутствие L. monocytogenes в яйцепродуктах считается потенциально опасным, так как эти бактерии относительно термостойки.

С целью уменьшения возможности попадания патогенных микроорганизмов и снижения общей бактериальной обсемененности меланжа рекомендуется яйца до разбивания обрабатывать дезинфицирующими веществами. Иногда проводят кратковременную пастеризацию меланжа при температуре 65-70 °С с выдержкой в течение 1-2 мин.

Яичный порошок сразу после высушивания имеет влажность от 4 до 8 %. В нем остаются в жизнеспособном состоянии аэробные бациллы, микрококки, стафилококки, споры мицелиальных грибов.

В процессе хранения яичного порошка микроорганизмы, сохранившие свою жизнеспособность при сушке, не размножаются и постепенно отмирают. Степень отмирания зависит от условий хранения. Так, при температуре 18-20 °С отмирает больше микроорганизмов, чем при температуре 1-2 °С. Наиболее интенсивное отмирание микробов наблюдается в первые 2-3 мес. хранения сухих яичных продуктов. Однако полной гибели всех вегетативных форм бактерий не происходит даже после 2-3 лет хранения.

7.3. Отбор проб

Санитарно-микробиологическое исследование яиц проводят по эпидемиологическим показаниям при вспышках инфекционных заболеваний птиц и подозрении на контаминацию яиц патогенными микроорганизмами, а также по требованию Госсанэпиднадзора.

Для анализа яиц из разных мест партии методом случайной выборки отбирают яйца в количестве 30 шт., в некоторых случаях - не менее 5-10 шт. Яйца, предназначенные для микробиологического исследования, упаковывают в чистую тару и транспортируют, избегая вторичной контаминации.

Для микробиологического исследования меланжа отбирают 1 % от общего числа банок одной партии, но не менее 6 шт. Перед вскрытием запаянной металлической банки на ее поверхность кладут пропитанный спиртом тампон и поджигают его. С соблюдением правил асептики из каждой взятой для исследования банки отбирают кусочки неоттаявшего меланжа и переносят в стерильную посуду (колбы, банки). После размораживания содержимое колбы тщательно перемешивают и отбирают для анализа среднюю пробу меланжа массой 50-55 г.

При контроле яичного порошка, расфасованного в пакеты, от каждой партии отбирают из разных мест по три упаковочные единицы, а расфасованного в банки - по одной единице. По каждой партии подготавливают объединенную пробу массой 0,5 кг, которую тщательно перемешивают, помещают в стерильные стеклянные банки с притертыми пробками и отправляют в лабораторию на исследование.

7.4. Бактериологическое исследование яиц и яйцепродуктов

Бактериологическое исследование яиц и яйцепродуктов включает в себя определение КМАФАнМ, наличие БГКП, протея, сальмонелл, золотистого стафилококка, при необходимости Bacillus cereus.

Общую бактериальную обсемененность поверхности яиц определяют путем посева конкретного объема смыва или его десятикратных разведений в чашки Петри с МПА. После инкубации чашек при температуре 30 °С в течение 72 ч подсчитывают все выросшие поверхностные и глубинные колонии, определяют среднее арифметическое число колоний по двум чашкам одного разведения, умножают на величину разведения и делят на площадь поверхности яиц:

КМАФАнМ = n 10^m/ S, КОЕ/см²,

где n - среднеарифметическое число колоний, выросших на чашках Петри; m - число десятикратных разведений; S - площадь поверхности яиц (см²), определяемая по формуле

S = 3, 14 BP/2,

где В - ш ирина яйца, см; Р - длина окружности, см.

Определение КМАФАнМ внутреннего содержимого яйца. Поверхность скорлупы обмывают с помощью щеточки теплой мыльной водой, затем яйцо на 10 мин погружают в этанол и обжигают на пламени горелки. На остром конце яйца делают отверстие диаметром 1 см, пробивая скорлупу профламбированным инструментом (пинцетом или скальпелем). Содержимое одного или нескольких яиц, помещенное в колбу с шариками, гомогенизируют до однородной массы, которую подогревают на водяной бане при температуре 20 °С. Затем 10 см³ яичной массы вносят в колбу с 90 см³ стерильного физиологического раствора, получая разведение 10^-1, из которого готовят последующие разведения и далее проводят определение КМАФАнМ, как это описано в разделе 1.3.1.

Определение БГКП. Для выявления БГКП высевают 1 см³ разведения 10 исследуемой пробы в 5 см среды Кесслера, посевы помещают в термостат с температурой 37±1 °С на 24 ч, после чего устанавливают наличие или отсутствие признаков размножения этих бактерий.

Для определения БГКП в сухих молочных продуктах готовят разведения до 10^-3, в меланже - до 10^-4, которые также засевают в пробирки со средой Кесслера.

Определение Staphylococcus aureus. Метод определения золотистого стафилококка в яйцепродуктах основан на высеве самого продукта или его разведений в селективные питательные среды. Особенностями золотистого стафилококка являются его способность расти на средах с повышенным содержанием натрия хлорида, коагулировать плазму крови, образовывать кислоту при расщеплении маннита и мальтозы в аэробных условиях.

Навеску сухого яичного продукта массой 1 г (для жидких яичных продуктов - 1 см³) высевают в пробирку с 9 см³ солевого бульона. Посевы инкубируют в термостате с температурой 37±1 °С в течение 24 ч, после чего материал из пробирок пересевают в чашки Петри с подсушенным желточно-солевым агаром (см. прил. п.1.8). Чашки выдерживают в термостате с температурой 37±1 °С в течение 18-24 ч. Затем в целях выявления пигментов чашки выдерживают на свету при комнатной температуре еще в течение 18-24 ч. Колонии Staphylococcus aureus на желточно-солевом агаре имеют форму выпуклых дисков диаметром 2-4 мм желтого, кремового, лимонного или золотистого цвета с радужным кольцом вокруг них. Из колоний, характерных для S. aureus, готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. В случае присутствия в препарате грамположительных кокков, расположенных в виде виноградных гроздьев, материал из подозрительных колоний отсевают в чашки Петри на МПА. Посевы ставят в термостат с температурой 37±1 °С на 18-24 ч. Из выросших подозрительных на S. aureus колоний ставят реакцию плазмокоагуляции. Для этого в две пробирки вносят по 0,5 см³ разведенной кроличьей плазмы; в одну пробирку вносят петлей материал из колонии, другая пробирка служит контролем - её не засевают. Пробирки ставят в термостат с температурой 37±1 °С, через 2-4 ч пробирки просматривают, учитывая результат, и оставляют их до утра при комнатной температуре для окончательного учета. Реакция плазмокоагуляции зависит от степени активности фермента коагулазы, выделяемого золотистым стафилококком, и характеризуется следующим образом:

✵ сгусток плотный, при наклоне пробирки неподвижен (оценка в четыре плюса);

✵ сгусток имеет небольшой отсек, при наклоне пробирки подвижен, плотная коагуляция плазмы (три плюса);

✵ сгусток в виде взвешенного мешочка, неполная коагуляция плазмы с образованием подвижного сгустка в центре плазмы (два плюса).

Материал из колоний, выросших на желточно-солевом агаре и подозрительных на S. aureus, пересевают петлей в чашки Петри на агаризованную среду с маннитом (или мальтозой) и феноловым красным. Положительным считается результат, если вокруг колонии на среде с маннитом образуется желтая зона, четко контрастирующая с пурпурно-красным фоном среды.

При наличии в мазках из характерных колоний на желточносолевом агаре грамположительных кокков, расположенных в виде гроздьев, установлении положительной реакции плазмокоагуляции, ферментации маннита с образованием кислоты дается положительный ответ на присутствие в 1 г (или 1см³) яичного продукта Staphylococcus aureus.

Методы выявления сальмонелл и бактерий рода Proteus описаны в разделах 1.3.3. и 1.3.4.

В табл. 7.1. приведены критерии микробиологической безопасности яичных продуктов.

Таблица 7.1. Микробиологические показатели яиц и яичных продуктов

На каждую партию яиц и яйцепродуктов предприятием- изготовителем выдается санитарно-ветеринарное заключение об их безопасности и качестве.

Задание по теме:

1. Определить КМАФАнМ яичного порошка.

2. Определить бродильный титр БГКП меланжа.

3. Определить наличие протея в меланже.

Контрольные вопросы

1. Какие микроорганизмы вызывают порчу яиц?

2. Чем обусловлена стойкость внутреннего содержания яйца к различным микробам?

3. По каким микробиологическим показателям проводят исследование яиц и яйцепродуктов?

4. Как отбирают пробы для микробиологического исследования яиц, меланжа, яичного порошка?

5. Как определяют S. aureus в яйцепродуктах?

6. Каковы характерные особенности золотистого стафилококка?

7. Какие виды порчи яиц Вы знаете?