Основы молекулярной биологии. Часть 2: Молекулярные генетические механизмы - А.Н. Огурцов 2011

Основные молекулярные генетические механизмы
Специфика ДНК

Нуклеиновые кислоты представляют собой полимеры из нуклеотидов, формирующих сахарофосфатный остов с чередующимися четырьмя нуклеиновыми основаниями: А, Т, С, G в ДНК и A, U, С, G в РНК (рисунок 2).

ДНК представляет собой двойную спираль, состоящую из двух правых спиралей, соединенных водородными связями между комплементарными парами оснований А=Т, C=G.

Основной формой ДНК является В-форма, однако встречаются и A-форма, особенно в случае образования РНК-ДНК и РНК-РНК двойных спиралей, а также Z-форма, которую имеют некоторые короткие молекулы ДНК. Функция Z-формы в клетке пока не выяснена. И, наконец, синтетические полимеры поли-А и поли-U могут образовывать тройные спирали.

Основная В-форма ДНК, несмотря на достаточно высокую стабильность структуры, обеспечиваемую множественными водородными и гидрофобными взаимодействиями, обладает значительной гибкостью.

Это свойство обеспечивает необходимую модификацию структуры ДНК при связывании белков со специфическими участками ДНК. В ДНК, в отличие от белковых а-спиралей, нет водородных связей, параллельных

основной оси. Это свойство позволяет молекуле ДНК изгибаться при объединении с белками, управляющими эволюцией ДНК (рисунок 3).

Высокая гибкость ДНК обеспечивает плотную упаковку ДНК в нуклеосомы хроматина - ДНК-белкового комплекса, из которого формируются хромосомы эукариот.

В ходе процессов репликации и транскрипции ДНК две спирали двойной спирали должны разъединяться с тем, чтобы позволить "внутренним" краям оснований спариваться с соответствующими комплементарными основаниями, формируя новую полинуклеотидную цепь.

Рисунок 2 - Схема строения ДНК: а - ван-дер-ваальсовая модель; б - схема химических связей в ДНК

Процесс раскручивания двойной спирали и разъединения двух спиралей называется денатурацией (или плавлением) ДНК.

Денатурация может быть индуцирована искусственно (in vitro) нагреванием раствора, содержащего ДНК. При повышении температуры усиливается тепловое движение в молекулах, и разрушаются слабые нековалентные связи, которые формируют двойную спираль. Спирали разъединяются и расходятся вследствие электростатического отталкивания между отрицательно заряженными сахарофосфатными остовами.

Рисунок 3 - Изгиб ДНК при связывании с С-доменом ТАТА-связывающего белка (ТАТА box-binding protein (TBP))

Вблизи температуры денатурации небольшое увеличение температуры раствора вызывает резкое, практически одновременное, разрушение множественных слабых нековалентных взаимодействий (которые удерживают двойную спираль) вдоль всей длины ДНК, что проявляется в резком изменении ультрафиолетового поглощения раствором (рисунок 4(a)).

Температура плавления, Тm, при которой разъединяются две спирали ДНК, определяется несколькими факторами.

Молекулы, которые содержат большее количество C=G пар плавятся при более высокой температуре, поскольку пары C=G, имеющие три водородные связи, более стабильны, чем пары А=Т, в которых только две водородные связи. Таким образом, по температуре плавления можно оценить концентрацию C=G пар (рисунок 4(6)).

Рисунок 4 - Температура денатурации ДНК: а - поглощение ультрафиолета; б - зависимость температуры плавления Тm от концентрации G=C пар

Концентрация ионов в растворе также влияет на Тm, поскольку отрицательно заряженные фосфатные группы обеих спиралей экранированы положительными ионами. Если снизить концентрацию положительных ионов в растворе, то уменьшается и степень экранирования. Это увеличивает силы отталкивания между сахарофосфатными остовами и снижает Тm.

Наконец, резкое изменение pH денатурирует ДНК даже при низких температурах. При низких значениях pH (кислая среда) нуклеиновые основания протонируются и, следовательно, приобретают положительный заряд, отталкивая друг друга. При высоких значениях pH (щелочная среда) основания теряют протоны, становятся отрицательно заряженными и опять-таки отталкиваются друг от друга.

Одноцепочечные молекулы ДНК, которые получаются в результате денатурации, образуют случайным образом сформированные клубки без определённой структуры.

Обратные процессы: (1) понижение температуры, (2) увеличение ионной концентрации или (3) нейтрализация pH вызывают самопроизвольную ренатурацию (или "отжиг") двух цепей ДНК в двойную спираль.

При этом, однако, важно, что две некомплементарные цепи ДНК неренатурируют, а остаются в виде хаотичных клубков. Ещё более важно, что они не мешают двум комплементарным цепям ДНК найти друг друга в растворе и ренатурировать.

Процессы денатурации и ренатурации (плавления или отжига) ДНК являются основами гибридизации ДНК - методики, которая используется для определения взаимного соответствия двух ДНК-образцов и для детектирования и изолирования специфических молекул ДНК в растворе, содержащем различные ДНК последовательности.