Основы молекулярной биологии. Часть 2: Молекулярные генетические механизмы - А.Н. Огурцов 2011

Использование клонов ДНК
Моноклональные антитела

Антитела синтезируются В-лимфоцитами, причем каждый В-лимфоцит производит единственный иммуноглобулин, комплементарный к единственной специфической химической структуре (называемой детерминантом или эпитопом) на молекуле антигена.

Когда млекопитающее инфицируется антигеном, В-лимфоциты, которые специализированы для синтеза антител, распознающих этот антиген, стимулируются к росту, размножению и синтезу антител.

Каждый В-лимфоцит, активированный антигеном, формирует клон клеток в селезенке или лимфатических узлах, в котором каждая клетка клона синтезирует идентичные молекулы антител - моноклональные антитела.

Поскольку антигены имеют множество эпитопов, то они вызывают одновременный рост многих различных клонов В-лимфоцитов, в результате чего образуется поликлональная смесь антител, распознающих разные эпитопы данного антигена. Как правило выделить моноклональные антитела из такой поликлональной смеси обычными методами биохимического разделения не удаётся, поскольку концентрация данного антитела чрезвычайно низка.

Время жизни обычных В-лимфоцитов недостаточно для синтеза необходимого промышленного количества моноклональных антител. Поэтому используют гибридомы - клоны гибридных клеток, которые получены путем слияния необходимых В-лимфоцитов из селезенки мыши и раковых лимфоцитных клеток миеломы. Такое слияние стимулируют специальной обработкой клеток особыми вирусными гликопротеинами или химически (с помощью полиэтиленгликоля). В результате плазматические мембраны двух клеток объединяются, а цитозоль и органеллы перемешиваются.

Те из таких объединенных клеток, которые сохраняют способность к бесконечному (раковому) делению, и формируют гибридому. Каждая гибридома синтезирует моноклональные антитела, кодируемые родительским В-лимфоцитом.

Затем необходимо отселектировать клетки гибридомы как от не слившихся родительских клеток, так и от спонтанно слившихся клеток, не содержащих в себе компонентов гибридомы.

Схема селекции представлена не рисунке 110.

Рисунок 110 - Схема получения гибридомы для синтеза моноклональных антител

Селекцию проводят с помощью селекционной среды "HAT", в которой не могут расти и размножаться мутантные клетки миеломы мыши (не имеющие ферментов HGPRT), но могут расти и размножаться нормальные (дикие) клетки селезенки мыши, некоторые из которых способны синтезировать антитела к данному антигену X.

Среда HAT содержит

1) пурин гипоксантин (Нypoxantine),

2) аминоптерин (Aminopteriri),

3) тимидин (Thymidine),

которые блокируют синтез глицина, пуриновых нуклеотидов и тимидин монофосфата из тетрагидрофолата (активной формы фолиевой кислоты).

В то же время немутантные (дикие) клетки способны проводить этот синтез из пуриновых оснований и тимидина с помощью специальных ферментов: тимидин киназа (ТК) и гипоксантин-гуанин фосфорибозил трансферази (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase, HGPRT).

Поэтому, образованные в результате слияния клетки гибридомы, получившие от нормальных клеток недостающие ферменты, способны расти и размножаться в среде HAT, а не слившиеся клетки миеломы - нет.

"Бессмертие" полученное в наследство от клеток миеломы поддерживает "бессмертие" клеток гибридомы, в то время как обычные лимфоциты селезенки мыши достаточно быстро отмирают.

Полученная таким способом гибридома затем культивируется для получения необходимого количества чистого моноклонального антитела.