Основы молекулярной биологии. Часть 2: Молекулярные генетические механизмы - А.Н. Огурцов 2011

Геномика и протеомика
Микромагрицы ДНК

Для одновременного мониторинга экспрессии тысяч генов используется метод анализа с использованием микроматриц ДНК.

Микроматрица ДНК (DNA microarray) состоит из тысяч наборов индивидуальных, плотно упакованных генных последовательностей, присоединенных к стеклянной подложке.

Сочетание этой методики с результатами секвенирования геномов позволяет исследователям изучать общую картину генной экспрессии организма в ходе специфического физиологического отклика или в процессе дифференциации.

Один из методов подготовки микроматрицы ДНК состоит в следующем (рисунок 117).

Сначала амплифицируют методом ПЦР участки генов длиной порядка 1 kb. Затем автомат наносит каждый такой амплифицированный образец на предметное стекло микроскопа в шахматном порядке, образуя матрицу размером 2x2 см, состоящую из «6000 образцов ДНК.

Затем такая микроматрица химически обрабатывается для того, чтобы прочно зафиксировать фрагменты ДНК на стекле и денатурировать двойные цепи.

Рисунок 117 - Схема микроматрицы ДНК: А - образцы ДНК; В - покрытие; С - предметное стекло; каждый образец имеет "адрес" (например, 1-а)

С помощью альтернативного метода, в котором олигонуклеотиды на стеклянной подложке синтезируются химически, начиная с первого, ковалентно связанного с подложкой нуклеотида, создаются микроматрицы ДНК, которые (поскольку такая технология была адаптирована из технологии производства интегральных микросхем в электронной промышленности) называют ДНК-чипами.

Для анализа экспрессии генов сначала готовят кДНК (меченые флуоресцентными зондами), которые соответствуют тем мРНК, которые экспрессируются клетками в данном исследовании.

Затем микроматрицу ДНК помещают в смесь, содержащую эти меченые кДНК. Меченые кДНК гибридизируются с теми ячейками матрицы, которые им комплементарны. Результат такой гибридизации детектируется сканирующим лазерным микроскопом в виде матрицы интенсивности флуоресценции от каждой из ячеек матрицы (рисунок 118).

Рисунок 118 - Распределение интенсивности флуоресценции матрицы ДНК

С использованием этого метода, например, была исследована экспрессия генов в дрожжах в зависимости от того, какая среда использовалась в качестве источника углерода и энергии — глюкоза или этанол.

При этом кДНК дрожжей, выращенных в разных средах, маркировались различными флуоресцентными маркерами. На рисунке 119 эти маркеры изображены черными и белыми эллипсами (а в эксперименте использовались маркеры красного и зеленого цвета, соответственно).

Матрицу ДНК, содержащая порядка 6000 генов, поместили в смесь, содержащую одинаковое количество кДНК, полученных при выращивании клеток в среде с этанолом и в среде с глюкозой. После гибридизации остатки смеси слили, а интенсивность флуоресценции каждой из ячеек проанализировали, используя микроскоп.

Относительная интенсивность красного или зеленого свечения (на рисунке 119 - это черные или белые эллипсы, или их смесь - серые эллипсы) соответствовала относительной интенсивности экспрессии данного гена (соответствующего данной ячейке матрицы) в среде с глюкозой или этанолом.

Рисунок 119 - Определение влияния источника углерода на экспрессию генов в дрожжах: а - матрица ДНК в смеси кДНК; б - флуоресценция ячеек матрицы после гибридизации с кДНК

Если интенсивность экспрессии какого-либо гена была одинаковой в обеих средах, то ячейка светилась желтым светом (желтый цвет - это смесь зеленого и красного цветов). Гены, которые вообще не транскрибировались в условиях эксперимента, не давали никакого флуоресцентного сигнала.

С помощью такого метода было определено, что замена среды содержащей глюкозу на этанол-содержащую среду привело к усилению приблизительно вдвое экспрессии 710 генов, в то время как экспрессия 1030 других генов снизилась более чем вдвое. И хотя функции около 400 из этих генов ещё не известны, этот результат может стать первым шагом в определении их функций в биологии дрожжей.