Общая микробиология - Шлегель Г. 1987

Рост микроорганизмов
Элективные методы культивирования

Познанием многообразия микроорганизмов мы обязаны двум обстоятельствам. Некоторые микроорганизмы уже давно привлекли к себе внимание тем, что они образуют колонии, крупные скопления или же вызывают заметные изменения в окружающей среде. Многие из таких легко обнаруживаемых микроорганизмов поддаются прямому выделению. Для них легко подобрать условия, которые обеспечивали бы их рост. Однако есть много других микроорганизмов, относящихся к различным физиологическим группам, которые стади доступными для исследования лишь после того, как Виноградский и Бейеринк разработали технику накопительных культур.

Накопительные культуры. Метод накопительных культур и в принципе, и на практике очень прост. Для накопления нужны такие условия, при которых данный организм преодолевает конкуренцию остальных. Подбирая ряд факторов (источники энергии, углерода, азота, акцепторы электронов, газовую атмосферу, освещенность, температуру, pH и т. д.), создают определенные условия и инокулируют среду смешанной популяцией, какая имеется, например, в почве или в иле. Наиболее приспособленный к такой среде микроорганизм растет и вытесняет все остальные, сопутствующие организмы. Путем многократных пересевов в такую же жидкую среду и посева на твердую среду того же состава можно без труда выделить преобладающий (накопленный) штамм. Частый пересев с жидкой среды на жидкую предотвращает рост сопутствующих организмов, которые могли бы использовать продукты выделения или даже автолиза клеток первичной культуры. Лучшим материалом для инокуляции служат пробы из тех мест, где уже имеется «естественное обогащение». Можно, например, выделять микроорганизмы, использующие окись углерода, из сточных вод газовых заводов; использующие гемоглобин - из сточных вод боен, а те, которые окисляют углеводороды, - из почвы на нефтепромыслах или из нефтяных отстойников.

Метод накопительных культур позволяет выделять микроорганизмы с любой комбинацией потребностей в питательных веществах - если, разумеется, искомый тип вообще существует в природе. Особенно легко создать элективные условия для крайне специализированных микроорганизмов. Например, минеральная среда, не содержащая соединений азота, на свету строго избирательна для цианобактерий, фиксирующих N₂. Если ту же среду дополнить органическим источником энергии и углерода, на ней в темноте в аэробных условиях будет развиваться Azotobacter, а без воздуха - Clostridium. Для успешного получения накопительных культур следует ограничиться удовлетворением минимальных потребностей только того микроорганизма, который хотят выделить. Если, например, нужно выделить бактерии, способные окислять метанол или Н₂ с нитратом или сульфатом в качестве акцептора электронов, то следует исключить доступ O₂, иначе будут доминировать аэробные формы, окисляющие метанол или водород. Для отбора можно также использовать устойчивость или толерантность микроорганизмов к кислотам и щелочам, высоким температурам или излучению. Наконец, часто наряду с «положительной» селекцией может проводиться и «отрицательная» - при помощи избирательно действующих ингибиторов. На среде, содержащей азид, в присутствии O₂ растут, например, молочнокислые бактерии, а рост аэробных микроорганизмов подавляется. Азид, цианид и H₂S оказывают избирательное угнетающее действие на те аэробные организмы, в дыхании которых участвуют цито- хромы. В медицинской диагностике избирательным торможением роста пользуются для выявления Corynebacterium diphtheriae (применение среды с теллуритом) и патогенных Enterobacteriaceae (агаризованные среды с висмутом). О применении пенициллина для отбора ауксотрофных мутантов Escherichia coli мы еще будем говорить в разделе 15.2.3. Для подавления роста грам-положительных бактерий к питательной среде добавляют пенициллин. Рост мицелиальных грибов, дрожжей, простейших и других эукариот ингибируют добавлением циклогексимида.

В посевном материале, используемом в эксперименте, могут присутствовать разные штаммы с одинаковым типом метаболизма, отличающиеся друг от друга лишь незначительно, например только по оптимуму pH и по скорости роста. Если для получения накопительной культуры использовать такой материал, то доминировать будет наиболее приспособленный к данным условиям или наиболее быстро растущий штамм; все же остальные будут подавлены и выделить их не удастся. Поэтому в тех случаях, когда хотят выделить как можно больше штаммов, растущих при определенных селективных условиях, посев следует производить непосредственно в чашки. На твердых элективных средах штаммы, для которых условия благоприятны, образуют отдельные колонии. При достаточно большом расстоянии между колониями конкуренция за питательные вещества не может иметь места: штаммы, растущие более медленно, не подавляются растущими быстрее, так что те и другие могут быть выделены раздельно.

Таблица 6.3. Элективные условия для некоторых бактерий

ИП - инокулят пастеризован; ДЭ - дрожжевой экстракт

В обзорной таблице 6.3. указаны важнейшие элективные условия для роста типичных представителей групп микроорганизмов с определенными типами обмена веществ.

Чистая культура. Под чистой культурой понимают потомство одной единственной клетки (клон). Получить чистую культуру, с несомненностью доказать ее чистоту и уберечь от загрязняющих организмов — главная задача микробиолога. Чистые культуры микроорганизмов, за редкими исключениями, выделяют на поверхности или внутри твердой питательной среды. Процедура начинается с отделения от клеточной популяции одной-единственной клетки, причем вырастающая из клетки колония тоже должна оставаться изолированной от других клеток и колоний. Аэробные бактерии выделяют по методу Коха - рассеивают суспензию по поверхности среды в чашках Петри или применяют менее трудоемкий метод - размазывают каплю платиновой петлей по агаризованной среде (рис. 6.3). Анаэробные бактерии суспендируют в расплавленном агаре (45°С) и проводят инкубацию без доступа воздуха (рис. 6.4). Тщательное отделение одной колонии, повторное суспендирование в жидкой среде и повторное нанесение штриха или разведение в агаре позволяют получать чистые культуры большинства микроорганизмов.

Рис. 6.3. Посев истощающим мазком для выделения чистой культуры аэробных бактерий. На агаризованную среду с помощью платиновой петли наносят каплю бактериальной взвеси. Последовательное размазывание капли уменьшает плотность культуры. Последние, единичные колонии выросли с высокой степенью вероятности из отдельных клеток. Колония в верхней части снимка - результат загрязнения из воздуха. (Фото В. Lehmann.)

Можно выделять чистую культуру и в жидких средах, если искомые организмы численно преобладают в исходном материале. Путем последовательного разбавления суспензии питательной средой можно в конце концов добиться того, чтобы на последней ступени разведения была выделена лишь одна клетка. В этом случае будет получен клон, т. е. чистая культура.

Рис. 6.4. Ряд разведений культуры пурпурной серобактерии в полужидкой агаризованной среде (0,8% агара) после недельной инкубации на свету. Снимок иллюстрирует способ выделения чистой культуры аэробных бактерий (метод разведения и размешивания). Столбик агара покрыт смесью парафина и парафинового масла для устранения доступа воздуха. (Фото В. Lehmann.)

Смешанные культуры. Естественные популяции, как правило, представляют собой смесь различных микроорганизмов. Между ними существуют самые различные формы взаимодействия; это может быть конкуренция за общий субстрат, комменсализм или мутуализм (см. разд. 17.2). Для изучения этих и других форм взаимодействия все чаще используют смешанные культуры. Если создать определенные заданные условия, то как в периодических, так и в непрерывных проточных культурах можно наблюдать последовательную смену (сукцессию) отдельных организмов и накапливаемых продуктов обмена. Это в свою очередь позволяет делать выводы о синэргистических или антагонистических взаимоотношениях между различными организмами. Смешанные культуры могут быть приготовлены путем объединения чистых культур. Исследования, проводимые на смешанных культурах заданного состава, дают возможность понять, какими могут быть сложные формы взаимодействия микроорганизмов в местах их естественного обитания.

В домашнем обиходе и в промышленности применяют отнюдь не только чистые, но и смешанные культуры. Некоторые из них назвали «естественными чистыми расами». Примерами могут служить кислое тесто, кефир, чайный гриб и «чистые расы» дрожжей. Большую роль смешанные культуры играют также при очистке сточных вод.