Биологические мембраны - А. Н. Огурцов 2012
Электрогенез биомембран
Ионные каналы
Пэтч-метод исследования ионных каналов
Революцию в исследовании ионных каналов совершили в 1976 году Эрвин Неер (Erwin Neher) и Берт Сакман (Bert Sakmann) (Нобелевская премия по физиологии и медицине 1991 года "за открытия, касающиеся функций одиночных ионных каналов в клетках"). Они предложили использовать стеклянные пипетки микроэлектродов (с несколько более толстым наконечником, чем те, которые использовались для исследования мембранных потенциалов), но не вводить их сквозь мембрану, а плотно прижимать и, за счёт небольшого снижения давления, "присасываться" кончиком микропипетки к поверхности мембраны (рисунок 97).
Такая методика "пэтч-фиксации" (patch-clamp technique) позволила более чем в 100 раз увеличить чувствительность электрических измерений и дала возможность изучать функцию одиночного ионного канала в реальном времени, поскольку наблюдение велось только за тем участком биомембраны, который оказался внутри кончика микропипетки. Плотный контакт (seal) микропипетки с поверхностью биомембраны обеспечивает чрезвычайно высокое электрическое сопротивление (чрезвычайно низкую электрическую проводимость) такого контакта порядка нескольких гигаом (1 ГОм = 109 Ом). Такой "гигаконтакт" (gigaseal) гарантирует, что электрический ток, который будет протекать через микропипетку, тождественен току, который проходит через присоединённый к кончику микропипетки участок биомембраны.
Рисунок 97 - Схема "пэтч"-регистрации: вверху - схема присоединения стеклянной микропипетки (1) к поверхности биомембранві (4) с образованием плотного контакта (3), при котором только два ионных канала (2) оказываются внутри кончика микропипетки. Внизу - четыре стандартных варианта "пэтч"-регистрации
Использование техники пэтч-контактов позволяет зарегистрировать работу единичного ионного канала - изменения тока между открытым и закрытым состояниями ионного канала с микросекундным разрешением во времени (рисунок 98).
Более того, преимуществом этого метода является исследование работы ионных каналов в естественном мембранном состоянии, причём в неповреждённой клетке.
Четыре стандартных варианта пэтч-регистрации. Метод пэтч-регистрации активности каналов чрезвычайно гибок. Он позволяет как проводить исследования на неповреждённой клетке (рисунок 97(a)), так и манипулировать фрагментами биомембраны.
Можно, например, "оторвать" присоединённый к кончику микропипетки фрагмент биомембраны с ионными каналами (рисунок 97(6)) или "прорвать" мембрану и, соединив напрямую цитозоль с внутренней частью электрода (whole-cell mode), отслеживать работу всех ионных каналов клетки (рисунок 97(b)).
Рисунок 98 - Пэтч-сигнал ацетилхолинового рецептора
И, наконец, можно, отделив участок мембраны от клетки, моделировать изменение химических условий в клетке за счёт введения определённых веществ через сравнительно толстую регистрирующую микропипетку (рисунок 97(г)).