Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Выделение плазмидной и фаговой ДНК
Минипрепаративное выделение плазмидной ДНК (минипреп)

Плазмида - внехромосомный самовоспроизводящийся генетический элемент (фактор наследственности) бактерий и некоторых других организмов, в частности дрожжей. Все векторы для клонирования ДНК получены на основе плазмид либо вирусов. Векторы составляют основу как генетической, так и белковой инженерии. Кроме того, рекомбинантную ДНК, т.е. ДНК вектора, объединённую с нужной исследователю ДНК, применяют в клеточной инженерии, инженерной энзимологии, генной терапии и др.

Плазмида представляет собой кольцевую (очень редко - линейную) двухцепочечную молекулу ДНК, способную к автономной репликации в клетке организма-хозяина. Векторная плазмида - переносчик ДНК.

Среди методов выделения плазмидной ДНК наиболее распространены разновидности метода щелочного лизиса клеток бактерий, разработанного Бирнбоймом и Доли в 1979 году (Birnboim, Doly, 1979). Они позволяют легко отделить плазмидную ДНК от высокомолекулярной хромосомной ДНК. Пептидогликан (муреин) клеточной стенки разрушают лизоцимом, а мембрану клетки-хозяина растворяют детергентом SDS в щелочных условиях при значении рН около 12,5. Хромосомная ДНК при этом фрагментируется и денатурирует необратимо. Плазмидная ДНК также денатурирует, но не фрагментируется ввиду её небольшого размера и обе цепи ДНК остаются сцепленными. При понижении рН после добавления раствора ацетата калия с рН 5,0, обе цепи плазмиды ренатурируют друг с другом. Одноцепочечные фрагменты хромосомы из разных клеток ренатурируют (регибридизуются) случайным образом и образуют высокомолекулярный творожистый осадок. Этот осадок легко отделяется центрифугированием от оставшейся в растворе плазмиды, которую затем осаждают этанолом. Поскольку in vivo ДНК не бывает свободной от белков, то необходима депротеинизация образца.

Репликативная форма фагов, существующая внутри инфицированных клеток бактерий, также представляет собой молекулы двухцепочечной кольцевой ДНК и легко выделяется методом щелочного лизиса клеток.

Приведённый протокол представляет собой одну из модификаций метода щелочного лизиса клеток бактерий. Это один из лучших методов для получения плазмидной ДНК высокого качества. Его достоинствами являются простота и высокая скорость, сравнимая только с выделением ДНК на микроколонках. Количества ДНК достаточно для нескольких рестрикций. При масштабных проектах используют процедуру максипреп (работа 4.2).

Плазмида pBR322, препарат ДНК которой предполагается получить, - один из первых векторов молекулярного клонирования (Bolivar et al., 1977).

Материалы и оборудование

Штамм E.coli XL1-Blue (Stratagene^TM), трансформированный плазмидой pBR322 (см. прил. 1, 4), микроцентрифуга, шейкер.

Растворы

- Раствор I для выделения плазмидной ДНК: 50мМ глюкоза; 100мМ Tris-HCl, pH 8,0; 10мМ ЭДТА. Хранить при +4°С, перед использованием добавить лизоцим до 5 мг/мл.

- Раствор II ^а 0,2N NaOH; 1% SDS. Готовить свежий раствор перед использованием, допускается лишь непродолжительное хранение при комнатной температуре в плотно закрытой пластиковой посуде.

- Раствор III. 3М ацетат калия, рН 5,0. На 100 мл: 5M ацетат калия - 60 мл; CH₃COOH ледяная - 11,5 мл; H₂O - 28,5 мл.

- Смесь фенол-хлороформ (работа 1.1)

- Смесь хлороформ-изоамиловый спирт (работа 1.1).

- Ампициллин. Раствор 100 мг/мл в воде.

Методика

1. Вырастить культуру клеток E.coli с плазмидой pBR322 в 5 мл питательной среды 2YT (тема 1), содержащей 100 мкг/мл антибиотика ампициллина, в течение 16-24 ч на термостатируемой роторной качалке-шейкере при температуре 37°С и скорости 200-300 об/мин.

2. Осадить клетки из культуральной среды. Для этого поместить 1,5 мл «ночной культуры» E.coli в 1,7 мл микроцентрифужную пробирку и центрифугировать в течение 2 мин при 10000 об/мин. Удалить супернатант выливанием через край. Повторить осаждение в эту пробирку ещё 2 раза.

3. Центрифугировать 10 с дополнительно, отобрать остатки культуральной среды микропипеткой.

4. Ресуспензировать осадок в 200 мкл раствора I с помощью микропипетки или вортекса. Оставить при комнатной температуре на 5 мин ^б.

5. Добавить 400 мкл раствора II, сразу же резко встряхнуть, перевернуть 5 раз. Происходит лизис бактерий и щелочная денатурация ДНК. Поместить образцы на лёд (0°С) на 5 мин ^в.

6. Добавить 300 мкл холодного раствора III, 5 раз перевернуть пробирку и оставить на льду на 5 мин.

7. Центрифугировать в течение 5 мин при максимальной скорости центрифуги для осаждения хромосомной ДНК.

8. Супернатант, содержащий плазмидную ДНК, перенести микропипеткой в новую пробирку, содержащую 500 мкл изопропанола, смешать переворачиванием пробирки, оставить на 10 мин на столе.

9. Осадить плазмиду центрифугированием в течение 10 мин при максимальной скорости центрифуги, супернатант затем вылить через край, а остатки после короткого центрифугирования отобрать микропипеткой.

10. Плазмидный осадок растворить в 100 мкл TE-буфера (можно 200 мкл).

11. Раствор плазмидной ДНК необходимо подвергнуть дальнейшей очистке - провести фенольную депротеинизацию образца. Для этого добавить в пробирку равный объём смеси фенол-хлороформ, хорошо перемешать и разделить фазы центрифугированием (10 мин, 10000 об/мин).

12. Перенести верхнюю водную фазу в новую пробирку, добавить равный объём смеси хлороформ-изоамиловый спирт (помимо денатурации протеинов она удаляет остатки фенола), хорошо перемешать и разделить органическую и водную фазы центрифугированием в течение 3 мин.

13. Отобрать верхнюю водную фазу, добавить 1/10 объёма холодного раствора ЗМ ацетата калия, pH 5,0 и высадить ДНК этанолом. Для этого добавить в пробирку 1 мл холодного (-20°С) этанола и поместить образец на лёд или в морозильник не менее чем на 15 мин. На этой стадии можно прерваться: под спиртом очищенная ДНК, в принципе, может храниться годами. Но все три формы плазмиды, судя по опыту, перейдут в линейную форму.

14. Осадить плазмидную ДНК центрифугированием (10 мин, 10000 об/мин).

15. Добавить к осадку 1 мл 70% этанола для промывки осадка ДНК и центрифугировать 3 мин.

16. Слить супернатант, перевернуть пробирки на фильтр и подсушить осадок на воздухе в течение 0,5 ч. Растворить в 50-100 мкл воды. На электрофорез следует взять 5-10 мкл образца.

17. Провести при необходимости обработку образца рибонуклеазой для удаления РНК. Следует добавить к полученному препарату плазмиды 1/100 объёма раствора РНКазы А (10 мг/мл в 10 мМ Tris-HCl (pH 7,4), 15 мМ NaCl) и выдержать 0,5-1 ч при 37°С. РНКазу затем можно удалить с помощью фенола, если нужно. На ДНК этот фермент влияния не оказывает.

Примечания

^а Раствор II должен быть свежеприготовленным. Хранить его можно лишь ограниченное время, сроком до нескольких недель. Важно, чтобы в процессе хранения CO₂ из воздуха не нейтрализовал NaOH. Ёмкость должна быть с плотно завинчивающейся крышкой, лучше пластиковой, поскольку щёлочи растворяют стекло. ^б

^б Это время необходимо для работы лизоцима, ослабляющего пептидогликановый слой. Если фермент не добавлен (клетки кишечной палочки удовлетворительно лизируются и без лизоцима), можно сразу переходить к следующему пункту.

^в Превышение времени денатурации чревато тем, что плазмида денатурирует необратимо - одно кольцо сдвинется относительно другого так далеко, что достигнет локально устойчивого состояния. Необратимо денатурированные плазмиды вполне годятся для сиквенса, но они не режутся рестриктазами и обладают аномальной подвижностью.

^г Происходит нейтрализация щелочной среды. Хромосомная ДНК регибридизуется случайным образом, образуя большие сети, кольцевая же плазмидная ДНК благополучно

ренатурирует «сама на себя». Важно, чтобы нейтрализация была полной, не оставалось областей с вязким раствором. Нужно смешивать раствор вначале мягко, чтобы не фрагментировать геномную ДНК, но после того как она уже ассоциирует (приблизительно через 1 мин) надо встряхнуть посильнее. Растворы I, II, III для достижения нужного результирующего значения pH используются в объёмной пропорции 1:2:1,5.