Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Рестрикция ДНК

Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы) широко используются в работах по картированию геномов, клонированию генов, генотипированию и других молекулярно-генетических исследованиях в качестве «молекулярных ножниц». Рестриктазы расщепляют молекулы ДНК в определённых нуклеотидных последовательностях, называемых сайтами узнавания. Эти сайт-специфические эндонуклеазы способны делать разрывы внутри цепи ДНК в отличие от экзонуклеаз, деградирующих ДНК с концов. Первые рестриктазы были выделены Смитом (Smith, 1970; Smith, Nathans, 1973), само же явление рестрикции-модификации ДНК впервые было обнаружено Лурия (Luria, 1952) при изучении размножения фагов на разных штаммах бактерий.

Рестриктазы II типа узнают палиндромные последовательности нуклеотидов - последовательности, имеющие ось симметрии второго порядка. Так, сайт узнавания рестриктазы EcoRI из шести нуклеотидов -GAATTC- на комплементарной цепи ДНК в том же 5’→3’ направлении читается точно так же. Точка разрезания находится между G и первым A, именно там происходит разрыв фосфодиэфирной связи. Образующийся при рестрикции 5’-выступающий «липкий конец» имеет в длину 4 нуклеотида:

Эти ферменты, как правило, работают в форме димера, причем каждая субъединица белка гидролизует одну цепь ДНК независимо от другой. Однако на одноцепочечной ДНК они работают значительно медленнее. В зависимости от относительного расположения разрыва на комплементарных цепях ДНК получившиеся рестрикты обладают либо 5’-выступающими (EcoRI, BamHI, HindIII), либо 3’-выступающими (PstI) липкими концами. Большинство рестриктаз дают 5’-выступающие липкие концы (см. прил. 3).

На активность ферментов и полноту гидролиза ДНК может влиять целый ряд факторов - температура инкубации, ионный состав буфера, метод выделения ДНК и соответственно степень её загрязнения, а также уровень метилирования ДНК и специфичность метилирования. Результаты рестрикции оценивают с помощью электрофореза ДНК в агарозном геле.

Небольшие по размеру молекулы плазмидной или вирусной ДНК при ферментативном гидролизе с помощью какой-либо рестриктазы дают строго определённое ограниченное количество рестриктов (прил. 3, 13). Препараты геномной ДНК из-за большого количества рестрикционных сайтов и неизбежной фрагментации ДНК при её изоляции из клеток дают при электрофорезе шлейф из фрагментов ДНК или «шмер» (прил. 13).

Система рестрикции-модификации ДНК - это ферментативная система бактерий, состоящая из двух белков рестриктазы и метилазы, специфичных к одному и тому же сайту узнавания. Эта система разрушает попадающую в клетку чужеродную ДНК. Основная её функция - защита клетки от проникновения чужеродного генетического материала, прежде всего от бактериофагов и плазмид. Защита бактериального генома от собственной рестриктазы осуществляется с помощью метилирования аденина или цитозина соответствующим ферментом метилазой: метилированные сайты рестриктаза разрезать не способна.

Для любой ДНК с известной первичной структурой можно выяснить число и локализацию всех сайтов рестрикции с помощью специальных программ для рестрикционного картирования, к примеру, программы RestrictionMapper (http: //www. restrictionmapper. org).