Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Рестрикция ДНК
Рестрикция геномной ДНК эукариот

Хромосомная ДНК эукариот в сравнении с плазмидной, фаговой или митохондриальной содержит очень большое количество сайтов рестрикции. Кроме того, она всегда фрагментируется случайным образом при выделении, её препараты труднее очистить от белков, полисахаридов и других веществ. Помимо этого, степень её метилирования может сильно варьироваться, что оказывает сильное влияние на работу эндонуклеаз.

Обычно берут 3-5-кратный избыток фермента на 1 мкг ДНК и проводят рестрикцию в течение 2-6 ч или оставляют реакцию на ночь. 10 мкг ДНК большинства высших растений соответствует 10⁶-10⁷ геномам.

Концентрацию ДНК в растворе можно определить либо путём сравнения с известным стандартом при электрофорезе в агарозном геле, либо путём измерения оптической плотности разведённой аликвоты раствора ДНК.

При обработке геномной ДНК рестриктазами, узнающими палиндромы из шести нуклеотидов (EcoRl, BamHl, Pstl и другие распространённые рестриктазы), образуются рестрикты размером от десятков нуклеотидов до 20-30 kb. Таким образом, при полном рестрикционном гидролизе ДНК эукариот получается огромное число рестриктов, десятки и сотни тысяч. При электрофорезе подвергшаяся частичному или глубокому расщеплению геномная ДНК даёт шлейф из фрагментов разного размера. Визуализировать нужный фрагмент возможно только с помощью блот-переноса ДНК на нитроцеллюлозный или найлоновый фильтр и гибридизации ДНК по Саузерну с радиоактивно- или флуоресцентно-меченым зондом.

Так называемые «мелкощепящие» рестриктазы, узнающие палиндромы из 4 нуклеотидов (SauIІІA и др.), порежут геномную ДНК на более мелкие фрагменты и в большем количестве. Для эффективного разделения высоко- или низкомолекулярных фрагментов ДНК используют разные гели (тема 3).

Материалы и оборудование

Геномная ДНК из растений табака (кукурузы, петунии) с неизвестной концентрацией, рестриктаза BamHI, образец ДНК с известной концентрацией, спектрофотометр, термостат, обрудование для электрофореза.

Растворы

- 10х буфер для рестриктазы ВаmНІ: 100мМ Tris-HCl, pH 8,0; 50мМ MgCl₂; 1000мМ КСl; 0,02% Triton Х-100.

- 10х буфер для нанесения образца на гелъ (тема 3).

Методика

1. Определите концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра.

2. Оцените чистоту препарата путем измерения оптической плотности при длинах волн 260, 280 и 235 нм, т.е. на максимумах поглощения ДНК, белков и полисахаридов, соответственно. Для чистой ДНК характерны значения А260/А235 = 2,2-2,5 и А260/А280 = 1,8—1,9.

3. Гидролизуйте 1 мкг тотальной ДНК табака в 50 мкл реакционной смеси в течение 6 ч ^а, отбирая через каждый час аликвоту в 10 мкл и останавливая в ней реакцию, добавлением 1 мкл буфера для нанесения образца ^б.

4. Проведите электрофорез ДНК-рестриктов. Используйте в качестве контроля нерезаный образец ДНК. Сфотографируйте гель.

Примечания

^а При длительной инкубации некоторые рестриктазы могут проявлять star-активность (звездную, вторичную, штриховую активность), т.е. гидролизовать сайты с одним или несколькими «неправильными» нуклеотидами. Это необходимо учитывать, если планируется осуществлять молекулярное клонирование (англ. Molecular cloning).

^б Можно остановить (временно затормозить) биохимическую реакцию помещением пробирки на лёд. В этом случае при необходимости (неполный гидролиз, «недорестрикция») её легко можно возобновить. Если же она останавливалась с помощью ЭДТА, присутствующей в буфере для нанесения образца на гель, то нужно снова добавить ионы магния в эквимолярном количестве в реакционную смесь.