Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013
ПЦР
Проведение ПЦР-амплификации ДНК
ПЦР проводится в объёме 10-50 мкл. Рабочая концентрация праймеров в реакционной смеси составляет 0,2-1 пМ/мкл. Количество матричной ДНК, добавляемой в реакцию, колеблется в пределах от 10 нг (плазмидная ДНК) до 1000 нг (геномная ДНК). Рабочая концентрация Jag-полимеразы составляет
0,01-0,05 ед/мкл. Число циклов - 30. Считается, что скорость достраивания ДНК Taq-полимеразой при ПЦР составляет 1000 нуклеотидов в минуту.
Оптимальная концентрация праймеров часто подбирается эмпирически (расчёт см. в раб. 6.3). Не рекомендуется брать больше чем 50пМ на пробу, иначе возможен неспецифический отжиг и образование праймер-димеров. Обычно задают следующий режим работы ДНК-амплификатора:
1. Td = 95 oC, от 1 мин - предварительная денатурация матрицы, один этап
2. 25-30 циклов ПЦР:
Td = 95 oC, от 10 с - денатурация (denaturation)
Ta = 50-65 oC, от 30 с - отжиг праймеров (annealing)
Te = 72 oC, от 1 мин - элонгация, полимеризация (elongation, extension)
3. T = 72 oC, от 1 мин. - достройка незавершенных цепей, один этап
4. T = 4 oC. - режим хранения
В качестве примера приведён протокол ПЦР-амплификации митохондриального гена НАДН-дегидрогеназы гадюки Никольского (Великов с соавт., Вестник Саратовского госагроуниверситета, 2006, №3).
Материалы и оборудование
ПЦР-амплификатор, ДНК (общая) гадюки Никольского Vipera nikolskii (40 нг/ мкл), праймеры (10 пМ/мкл), смесь нуклеотидов dNTP-mix (2мМ), раствор хлорида магния (25мМ), Tag-полимераза (5 ед/мкл), 10x ПЦР-буфер.
Растворы
- Реакционная смесь. Подготовка смеси в конечном объёме 20 мкл:
1. 10х ПЦР-буфер (200мМ Tris-HCl, pH 8,4; 500мМ КС1; 0,01% Tween 20) - 2 мкл;
2. 2мМ dNTP mix (смесь из всех 4-х дезоксирибонуклеозидтрифосфатов c концентрацией по 2 мМ каждого) - 2 мкл;
3. 25мМ раствор MgCl2 - 2 мкл;
4. Праймер ND2 For: 5 - GCATTTTCATGACCACCACC-3’ - 2 мкл;
5. Праймер ND2 Rev: 5 - GAGTGAGGGGTAAGATAGTG-3’ - 2 мкл;
6. ДНК-мишенъ: общая ДНК гадюки Никольского (40 нг/мкл) - 3 мкл;
7. Вода деионизованная - 6,8 мкл;
8. Taq-полимераза - 0,2 мкл.
Методика
1. В стерильной пластиковой тонкостенной пробирке на 0,5 (0,2) мл смешать указанные выше компоненты, довести объём при помощи деионизованной воды до 20 мкл. Фермент добавлять последним, сразу убрать на -20°С!
2. Центрифугировать 15 с. Нанести поверх реакционной смеси немного минерального масла для предотвращения испарения (≈ 30 мкл пипеткой или каплей). Если ДНК-амплификатор имеет нагреваемую крышку, то масло добавлять не нужно. Поместить пробирки в ДНК-амплификатор.
3. Запустить следующий режим ПЦР: предварительная денатурация матрицы при 95°С - 5 мин, затем 30 циклов амплификации: 95°С - 30 с, 57°С - 30 с, 72°С - 1 мин, затем задать температуру 72°С - 5 мин (окончательная достройка цепей) и вывести на +4°С - режим хранения. Расчётная температура отжига обоих праймеров составляет 60°С, реальная задана на 3°С ниже для гарантии отжига и последующего «удлинения праймера».
4. Провести электрофорез ДНК, сфотографировать гель (фотографию электрофореграммы см. в прил. 11, размер ампликона 911 п.н.). При RealTime PCR форез не проводят, за процессом следят по флуоресценции.