Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013
Выделение общей ДНК из клеток
Выделение ДНК из бактерий
Процедура выделения ДНК из клеток и тканей часто является исходным (основным) этапом в исследовании живого организма на молекулярном уровне. От ДНК напрямую или через белки-ферменты зависят все биосинтезы и катаболизм клетки. Клетку необходимо разрушить тем или иным способом, а хромосомную ДНК очистить от других клеточных компонентов. Прежде всего, нужно отделить ДНК от белков, входящих в состав нуклеопротеидных комплексов хроматина. При этом важно защитить ДНК от действия нуклеаз и максимально сохранить её целостность, поскольку длинные линейные молекулы ДНК при их изоляции из клетки неизбежно фрагментируются.
Методы выделения ДНК обычно включают следующие этапы:
1) лизис клеток (или разрушение физическим, механическим способом);
2) ферментативное разрушение белков протеиназами и/или депротеинизацию клеточного лизата с помощью фенола и хлороформа; 3) центрифугирование для удаления денатурированных белков и фрагментов клеточных органелл. Затем ДНК осаждают из раствора этанолом и после центрифугирования растворяют осадок в буферном растворе. Вместе с ДНК частично выделяется и РНК, от которой избавляются с помощью фермента РНКазы.
Для лизиса клеток и денатурации белков часто используется детергент додецилсульфат натрия и хаотропный агент гуанидинизотиоцианат. Ряд современных методов предусматривает сорбцию ДНК на гранулах силикагеля в присутствии хаотропных веществ, центрифугирование и последующую элюцию ДНК с гранул в раствор. Некоторые фирмы продают наборы реактивов для выделения ДНК с использованием магнитных частиц, покрытых силикой SiO2. Некоторые коммерческие наборы предусматривают сорбцию ДНК на мембранах или ионообменных сорбентах. Фенолхлороформный метод экстракции ДНК считается стандартным.
Количественная и качественная оценка образца полученной ДНК осуществляется при последующей стандартной процедуре электрофореза ДНК в агарозном геле (тема 3) путём визуального сравнения с образцами известной концентрации. Спектрофотометрическое определение даёт более точную характеристику препарату ДНК (тема 2).
Выделение общей или тотальной ДНК из клеток бактерий с использованием додецилсульфата натрия, протеиназ и фенола (Dhaese et al., 1979) является достаточно распространённым подходом. Метод простой и надёжный, существует в ряде модификаций, как и многие другие методы.
Наряду с хромосомной ДНК выделяется также плазмидная и фаговая ДНК при их наличии в клетке, а также РНК, от которой несложно избавиться.
Плазматическая мембрана бактериальной клетки в этом методе разрушается под действием детергента додецилсульфата натрия (SDS, sodium dodecyl sulfate) - одного из самых распространённых поверхностно-активных веществ, или ПАВ. Целостность пептидогликанового слоя, так называемого муреинового мешка, при этом тоже нарушается. Путём обработки бактериального лизата фенолом, который денатурирует протеины, но не действует на нуклеиновые кислоты, удаляют все белки, в том числе белки нуклеоида. Другие органические соединения клетки и низкомолекулярные вещества теряются при высаживании ДНК этанолом, поскольку остаются в растворе. Полученный в результате центрифугирования образца осадок нуклеиновых кислот, дезоксирибонуклеиновой и рибонуклеиновой, растворяют в специальном буфере для хранения ДНК - буфере TE. Входящий в его состав хелатирующий агент - этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) предотвращает воздействие на ДНК клеточных нуклеаз, поскольку связывает необходимые для их работы катионы Mg2+.
Материалы и оборудование
Основное оборудование для проведения молекулярно-биологических исследований: микроцентрифуга, центрифуга для больших объёмов, термостатируемая качалка-шейкер, вортекс, термостат, источник тока, камеры для электрофореза, УФ-трансиллюминатор, термостат твердотельный для микропробирок, pH-метр, ДНК-амплификатор, электропоратор, спектрофотометр, микропипетки-дозаторы с одноразовыми наконечниками.
Для проведения практических работ необходимо также следующее лабораторное оборудование: ламинарный бокс, вытяжной шкаф, сушильный щкаф, холодильник, морозильник, весы, дистиллятор, электроплитка, СВЧ-печь, УФ облучатель, лабораторный пластик и посуда.
Для работы 1.1 необходим штамм энтеробактерии кишечной палочки Escherichia coli XL1-Blue (StratageneTM) или штамм почвенной бактерии азоспириллы Azospirillum brasilense Sp245. Характеристики используемых в практикуме бактериальных штаммов и плазмид приведены в приложениях.
Растворы
- Среда 2YT. На 1 л: триптон - 16 г; дрожжевой экстракт - 8 г; NaCl - 5 г. Довести до 1 л дистиллированной водой, рН среды 7,0. Для получения твёрдой среды в неё добавляют перед автоклавированием агар до 1,5%.
- 5% SDS. 5%-ный раствор додецилсульфата натрия (лаурилсульфата, саркозила, N-laurylsarcosine) в буфере ТЕ.
- Проназа. Раствор 5 мг/мл в буфере ТЕ.
- Буфер TE. 10мМ Tris-HCl, pH 8,0; 1мМ ЭДТА.
- 5М NaCl. Растворить 292,5 г NaCl в 800 мл воды и довести объём до 1 л.
- Смесь фенол-хлороформ. Водонасыщенный фенол (насыщенный после перегонки 0,1M Tris-HCl, pH 8,0) смешивают в пропорции 1:1 с заранее приготовленной смесью хлороформ-изоамиловый спирт.
- Смесь хлороформ-изоамиловый спирт. Вещества смешивают в пропорции 24:1 по объёму.
Методика
1. Произвести отдельной колонией посев бактерий штамма E.coli XLl-Blue (или A.brasilense Sp245) в пробирку с 5 мл жидкой питательной среды 2YT и растить культуру бактериальных клеток в течение ночи с аэрацией при 37°С (или 30°С, соответственно)а
2. Перенести микропипеткой 1,5 мл культуры в микроцентрифужную пластиковую пробирку типа Eppendorf объёмом 1,7 мл. Осадить клетки центрифугированием в течение 5 мин при 10000 об/мин. Заметьте, что это наиболее часто используемая скорость для микроцентрифуги, её устанавливают по умолчанию, если не указана другая скорость.
3. Удалить супернатант (вылить питательную среду через край: не бойтесь! осадок плотный). Добавить к осадку 300 мкл буфера ТЕ и с помощью микропипетки перевести клетки в суспензию вновь (ресуспензировать).
4. Добавить к суспензии клеток 100 мкл 5%-ного раствора SDS и перемешать переворачиванием пробирки 3 раза.
5. Добавить 150 мкл р-ра проназы (5мг/мл) и перемешать.
6. Инкубировать 1 (0,5) ч в термостате при температуре 37°С. Происходит лизис клеток и ферментативный гидролиз белков.
7. Высадить нуклеиновые кислоты из лизата спиртом. Для этого добавить в пробирку равный объём изопропанола (550 мкл) и центрифугировать в течение 10 минут. (После добавления спирта при необходимости можно прерваться; не центрифугировать пробу сразу, а убрать её в холодильник. «Под спиртом» ДНК может храниться долгое время).
8. После центрифугирования отобрать микропипеткой остатки жидкости из пробирки. Растворить осадок нуклеиновых кислот в 500 мкл буфера ТЕ и провести депротеинизацию образца, т.е. очистку ДНК от белков (пп. 9-12).
9. Добавить к раствору равный объём (500 мкл) смеси фенол-хлороформ и хорошо встряхнуть до образования стойкой эмульсии.
10. Разделить водную и органическую фазы путём центрифугирования в течение 5 мин. Фенол остается внизу, водная фаза с растворённой ДНК - вверху. Денатурированные фенолом белки диссоциируют с ДНК, теряют растворимость и собираются при центрифугировании на границе раздела фаз - в интерфазе. Т.е. идёт экстракция ДНК из ДНП-комплекса.
11. Перенести микропипеткой водную фазу, содержащую ДНК, в чистую 1,7 мл пробирку. При отборе важно не засасывать наконечник интерфазу - плотный слой белёсого цвета между водной и органической фазами в которой находятся агрегаты денатурированных молекул белков б.
12. Провести ещё одну экстракцию ДНК хлороформом и избавиться от примеси фенола. Для этого добавить в пробирку с образцом равный объём смеси хлороформ-изоамиловый спирт, перемешать и центрифугировать в течение 3 мин. Водную фазу перенести в чистую пробирку.
13. Оценить микропипеткой-дозатором или по меткам на пробирке получившийся объём водной фазы и добавить 1/25 объёма 5М NaCl до конечной концентрации соли 0,2М. Затем добавить 2,5 объёма холодного (-20°С) этанола для осаждения ДНК, точнее её натриевой соли. Оставить на 1-2 ч в морозильнике при температуре -20°С. Можно оставлять ДНК под спиртом и дольше, до того времени как образец потребуется.
14. Осадить нуклеиновые кислоты центрифугированием в течение 10 мин при максимальной скорости микроцентрифуги. Слить супернатант и промыть осадок. Для этого добавить к осадку 1 мл холодного 70% этанола и снова центрифугировать в течение 3 мин в.
15. Слить 70% этанол, перевернуть пробирки на фильтровальную бумагу. После того как вся жидкость стечет, пробирку с осадком нуклеиновых кислот (ДНК и РНК г) немного подсушить на воздухе до исчезновения запаха спирта д. Растворить осадок в 50 мкл буфера ТЕ. Для электрофореза ДНК (тема 3) достаточно 5-10 мкл образца.
Примечания
а О выращивании бактерий см. в руководствах по микробиологии. Некоторые сведения представлены в данном пособии только там, где это необходимо.
б Некоторый объём водной фазы при этом неизбежно теряется, до 1/5 объёма. На практике лучше пожертвовать этим объёмом сейчас, чем чистотой препарата впоследствии. Фенол - токсичное раздражающее вещество, необходимо исключить контакт с кожей и работать с микроколичествами, соблюдая меры предосторожности.
в Допускается просто слить 70 % спирт, без центрифугирования.
г Избавиться от РНК при необходимости можно с помощью фермента РНКазы (см. работу 4.1). Примесь РНК в препарате ДНК не влияет на рестрикцию или ПЦР.
д Пересушивать осадок нельзя, в полностью высушенном виде он практически нерастворим в воде. Обычно осадки сушат на открытом воздухе не более получаса, под потоком нагретого воздуха или в твердотельном микротермостате достаточно 5 мин.