Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Трансформация бактерий
Приготовление компетентных клеток E.coli

Трансформацию бактерий очищенной ДНК впервые осуществили Мандел и Хига (Mandel, Higa, 1970). При инкубации ДНК фага лямбда λ с клетками E.coli в растворе СаСl₂ при температуре 0°С произошло проникновение ДНК фага внутрь бактериальных клеток, что в дальнейшем привело к размножению фаговых частиц и лизису клеток бактериальной культуры. То есть произошло то же самое, что и при инфекции природным фагом. Однако в норме «голую» ДНК бактериальные клетки поглощать не способны (кроме гемофильных и ряда грам-положительных).

Последующее развитие метода шло эмпирическим путем. Современная процедура включает получение так называемых «компетентных» клеток E.coli, способных воспринимать чужеродную ДНК, «тепловой шок», при котором ДНК проникает внутрь клетки, и отбор трансформированных клеток путём выращивания бактериальной культуры в селективных условиях.

Плазмиды при проведении трансформации E.coli попадают только в очень небольшую часть (0,01-5%) клеток. Для отбора трансформированных клеток, несущих рекомбинантную ДНК, используют селективные маркеры, например, гены устойчивости к антибиотику. Многие векторы содержат ген устойчивости к ампициллину bla. Он кодирует фермент ß-лактамазу, который разрушает лактамное кольцо ампициллина (прил. 3, 4). После осуществления процедуры трансформации бактерии высеивают на питательный агар, содержащий ампициллин. При этом выживают и образуют колонии только те клетки, в которые попала плазмида и синтезируется активная ß-лактамаза. Эти клоны E.coli называют трансформантами. Другие векторы несут гены устойчивости к канамицину, тетрациклину (см. прил. 1).

Таким образом, получившие рекомбинантную плазмиду, т.е. трансформированные или изменённые по сравнению с исходными клетки приобретают способность размножаться на питательных средах, содержащих антибиотики. В то время как на остальные клетки бактериальной культуры антибиотики оказывают бактериостатическое или бактерицидное действие.

Разработанные позднее методы электротрансформации клеток обладают более высокой эффективностью по сравнению с «химической» или Са²⁺-трансформацией. Эти методы требуют специального оборудования для «электропробоя» мембран клеток - электропораторов (работы 8.3-8.4).

Приведённая процедура предполагает получение компетентных клеток E.coli путём их инкубации при низкой температуре в растворе, содержащем катионы Са²⁺ (Inoue, Nojima, Okayama, 1996). Чтобы повысить уровень трансформации помимо CaCl₂ в раствор добавляют различные вещества. Приобретшие компетентность «кальциевые клетки» следует использовать сразу (работа 8.2). Если по каким-то причинам это сделать невозможно, то 1-2 дня максимум они могут храниться в холодильнике при +4°С, пока полностью не утратят компетентность. Поэтому их лучше быстро заморозить в жидком азоте и хранить при -70°С. Все работы с компетентными клетками проводят на холоде, используя поддоны с мелкоколотым льдом или снегом.

Материалы и оборудование

Штамм E.coli XL1-Blue, диметилсульфоксид (ДМСО).

Растворы

- Среда SOB. 2% триптон; 0,5% дрожжевой экстракт; 10мМ NaCl; 2,5мМ KCl; 10мм MgCl₂; 10мМ MgSO₄.

- Буфер TB. 10мМ HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфо- новая кислота, можно исп. PIPES или BES); 15мМ CaCl₂; 55мМ MnCl₂; 250мМ KCl.

Методика

1. Рассеять бактерии штрихом на чашку с селективной агаризованной средой SOB, выращивать при 37°С в течение ночи.

2. Несколько колоний E.coli (10-12) диаметром приблизительно 2-3 мм поместить в 40 мл среды SOB в колбе на 0,5-1 л. Растить при интенсивном встряхивании на качалке при скорости вращения 200-300 об/мин до

оптической плотности OD₆₀₀ ⁼ 0,6 при температуре 37°С ^а. Обычно на это требуется 2-2,5 ч. Все дальнейшие манипуляции проводить на льду.

3. В 50 мл центрифужную пробирку поместить 30 мл культуры клеток, оставить при 0°С на 10-15 мин.

4. Центрифугировать 10 мин, 3000 об/мин, +4°С. Слить супернатант.

5. Центрифугировать 20 с, 3000 об/мин, +4°С. Удалить жидкость пипеткой.

6. Суспензировать в 10 мл буфера ТВ, оставить при 0°С на 10-15 мин.

7. Повторить п. 4 и п. 5.

8. Ресуспензировать осадок клеток в 2 мл буфера ТВ.

9. Добавить криопротектор ДМСО до 3,5% (70 мкл), оставить при 0°С на 1015 мин.

10. Повторить п. 4. Ресуспензировать клетки в остатках жидкости.

11. Разлить по 100 мкл в охлаждённые 1,7 мл пробирки. Использовать «кальциевые клетки» сразу или заморозить в жидком азоте.

Примечание

^а При выращивании бактерий при температуре 37°С получается компетентность среднего уровня. При росте культуры E.coli при 18°С компетентность клеток получается выше, но время роста до нужной плотности удлиняется до нескольких суток.