Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Электрофорез белков
Проведение электрофореза белков

Молекула белка в растворе имеет некий средний целочисленный заряд (положительный или отрицательный) при любом значении pH, отличающемся от изоэлектрической точки данного белка. Это обуславливает передвижение молекул в полиакриламидном геле под действием внешнего электрического поля. Кроме заряда на подвижность влияет размер белковых молекул.

Электрофорез проводят обычно при нейтральных или слабощелочных значениях pH, когда большинство белков мигрирует к аноду, так же как мигрирует при электрофорезе ДНК. За прохождением электрофореза следят по движению красителя бромфенолового синего (БФС). Краситель идёт с фронтом фореза, впереди него белков нет.

Материалы и оборудование

Электрофорезная камера с гелем, источник тока, образцы белков для анализа, маркеры молекулярного веса.

Растворы

- 2х буфер для нанесения образцов (работа 11.1).

- Раствор БФС (работа 11.1).

Методика

1. Подготовить образцы так, чтобы общая концентрация белка была не больше 10 мг/мл. Нужно 10 мкл образца разбавить 2х бу фером для нанесения образцов в два раза, добавить 4 мкл раствора БФС. Рекомендуется прокипятить образцы в течение 5 мин.

2. С помощью гамильтоновского шприца или микропипетки-дозатора с вытянутым наконечником нанести по 10 мкл образцов в лунки геля.

3. Подключить электрофорезную камеру к источнику тока, соблюдая полярность.

4. Провести электрофоретическое разделение белков при постоянном токе 20 мА, 60 В для одного геля и 60 мА, 150 В для другого геля. Повышать напряжение надо при прохождении БФС до разделяющего, нижнего геля. В этих условиях электрофорез длится 40-50 мин.

5. По достижению красителем нижнего края геля отключить ток.

6. Вынуть пластину с гелем из электрофорезной камеры.

7. Осторожно вынуть спейсеры, находящиеся между стеклами.

8. Отделить гель от стёкол ^а, окрасить.

Примечание

^а Для придания стёклам гидрофобных свойств для лучшего отделения геля их зачастую предварительно силиконируют с использованием bind-silane и repel-silane.