Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Приложение

Приложение 1. Характеристика плазмид и бактериофагов, приведенных в руководстве

Примечание. Ap^r - устойчивость к ампициллину, Km^r - устойчивость к канамицину, Cm^r - устойчивость к хлорамфениколу, Tc^r - устойчивость к тетрациклину

Приложение 2. Характеристика штаммов бактерий, приведенных в руководстве

Приложение 3. Сайты узнавания некоторых рестриктаз

Приложение 4. Рестрикционная карта плазмиды pBR322

Обозначения:

Цифры возле обозначения сайтов узнавания рестриктаз соответствуют номеру первого нуклеотида в сайте. Отсчёт ведётся от первого нуклеотида Т в сайте узнавания рестриктазы EcoRI. Показаны только уникальные сайты, причём для небольшого числа из множества рестриктаз, способных гидролизовать ДНК плазмиды pBR322 (≈ 50).

Ген устойчивости к ампициллину (полусинтетический антибиотик из группы пенициллинов, лактамное кольцо которого способна разрушать ß-лактамаза) инактивируется при клонировании ДНК по сайту рестриктазы Pstl. Ген устойчивости к антибиотику тетрациклину, кодирующий защитный белок - по сайту рестриктазы BamHI. Инсерционная инактивация этих генов при вставке «чужеродной ДНК» позволяет выявлять рекомбинантные плазмиды, поскольку у трансформированной такой плазмидой клетки исчезает устойчивость к тому или другому антибиотику, в то время как ко второму антибиотику сохраняется.

Приложение 5. Рестрикционная карта фагмиды pBluescript® II (Stratagene)

Обозначения:

Порядок расположения сайтов рестрикции в полилинкере MCS, начиная от промотора Рт7 (ориентация полилинкера): pBluescript II SK(+)

KpnI, XhoI, SalI, HindIII, EcoRI, PstI, SmaI, BamHI, XbaI, NotI, SacI; pBluescript II KS(+)

SacI, NotI, XbaI, BamHI, SmaI, PstI, EcoRI, HindIII, SaII, XhoI, KpnI.

Универсальные праймеры для секвенирования:

M13/pUC sequencing primer (- 20)

5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’ (перед промотором P_T7);

M13/pUC reverse sequencing primer (- 26)

5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’ (перед промотором P_T3).

Примечание. Как +-цепь, так, в принципе, и - -цепь ДНК фагмиды pBluescript® II может быть «упакована» в белковый капсид с получением вириона (фаговой частицы) после инфицирования клетки E.coli с этой фагмидой особым фагом-помощником. Одноцепочечная ДНК из вирионов удобна для секвенирования. Можно также секвенировать двухцепочечную ДНК фагмиды со вставкой «чужеродной ДНК» (или трансгена) по обеим цепям, для точности. При этом используют по отдельности тот или другой универсальный праймер.

Приложение 6. Схема устройства и использования лактозного оперона E.coli

Индукция гена ß-галактозидазы. Фермент ß-галактозидаза расщепляет дисахарид лактозу на галактозу и глюкозу. Индуктор лактозного оперона - лактоза. Она связывается с репрессором и способствует его диссоциации с промоторно-операторной зоны, обеспечивая прохождение транскрипции. Негидролизуемый аналог лактозы ИПТГ - изопропил-Р-О-тиогалактозид - также может выступать индуктором.

Сине-белая селекция при клонировании, ß-галактозидаза способна расщеплять субстрат X-gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-0-галактозид) на галактозу и индольное соединение голубой окраски. Колонии бактерий на питательном агаре с X-gal и ИПТГ (по 40 мкг/мл) имеют голубую окраску. При клонировании под промотор гена lacZ происходит инактивация гена, что приводит к появлению обычных («белых») колоний. При трансформации E.coli продуктами лигазной реакции получение клеткой плазмиды со вставкой «чужеродной ДНК» приведёт к появлению обычной, а не голубой колонии.

Явление а - комплементации. Синтез активного фермента в бактериальных клетках будет происходить, если его N-концевая часть кодируется плазмидой (например pBluescriptl II или др.), а С-концевая часть - встроенным в хромосому E.coli F-фактором. В этом случае штамм-хозяин должен иметь мутацию lacIq LacZ ∆M15 (конститутивный синтез репрессора Iq и N-концевая делеция гена ß-галактозидазы). Это позволяет располагать на векторе не весь ген lacZ, а только его часть.

Приложение 7. Некоторые соотношения между количеством, размером и оптической плотностью для нуклеиновых кислот

Приложение 8. Стандартные обозначения полиморфных позиций нуклеотидов

Приложение 9. Однобуквенные обозначения аминокислот

Приложение 10. Генетический код

Приложение 11. Электрофореграмма продуктов ПЦР-амплификации гена НАДН-дегидрогеназы гадюки Никольского и гена 12S рибосомной гРНК

Обозначения дорожек:

1. - маркер молекулярного веса 100bp DNA Ladder Plus (Fermentas). Размеры фрагментов ДНК, начиная сверху: 3000, 2000, 1500, 1200, 1034, 900, 800, 700, 600, 500 п.н.;

2-5. - ПЦР-продукт гена 12S рРНК размером 727 п.н.;.

6-7. - ПЦР-продукт гена НАДН-дегидрогеназы размером 911 п.н.

Приложение 12. Движение различных форм плазмидной ДНК при гель-электрофорезе

Обозначения дорожек:

1. - плазмидная ДНК pBluescript II, рестрицированная ферментом Eco31I;

2. - рестрицированная BamHI;

3. - с кассетой nptI-sacB-sacR, рестрицированная BamHI;

4. - рестрицированная PstI;

5. - нативный препарат плазмидной ДНК pBluescript II.

Формы плазмиды:

л - линейная (с разрывом в обеих цепях ДНК); с - суперспиральная кольцевая; ок - открытая кольцевая (с разрывом в одной цепи ДНК); мм - димерная и мультимерные; хром - остатки хромосомной ДНК; sacB - кассета nptI-sacB-sacR.

Приложение 13. Электрофореграмма продуктов рестрикции ДНК фага лямбда и геномной ДНК E.coli

Обозначения дорожек:

1. - нативная ДНК фага X размером 48502 п.н.;

2. - ДНК фага X, гидролизованная рестриктазой Hindill;

3. - тотальная ДНК E.coli, гидролизованная рестриктазой Hindill (неполный гидролиз)

Примечание. При гель-электрофорезе сравнивают электрофоретическую подвижность фрагментов ДНК или нативных молекул ДНК, находящихся в одной конформации: линейную форму сравнивают с линейной, суперспиральную - с суперспиральной, одноцепочечную - с одноцепочечной и т.д. Здесь нативная ДНК фага лямбда тоже линейная, хотя его репликативная форма в клетках E.coli замкнута в кольцо благодаря cos-сайтам.

Наиболее крупные фрагменты ДНК размером 23,1kb и 48,5kb эффективно не разделяются, поскольку использован 1,5% агарозный гель (см. тему 3). Низкомолекулярные фрагменты окрашиваются слабее, так как связывают меньше бромистого этидия EtBr, уходящего из ДНК при форезе к катоду. Здесь фрагмент размером 564 н.п. дорисован, поскольку был малозаметен, хотя молярные концентрации всех рестрикционных фрагментов одинаковы. При повышении общей концентрации ДНК верхние фрагменты постепенно сольются в одно яркое пятно.

Приложение 14. Схема клонирования ДНК

Примечание. В приведённой схеме кроме скрининга плазмид по размеру возможна «сине-белая селекция» рекомбинантной ДНК. При клонировании под промотор фага ТЗ (Ртз) нарушается целостность гена LacZ и фермент ß-галактозидаза в клетках не синтезируется. После высева клеток бактериальной культуры, трансформированной продуктами лигазной реакции на питательный агар с ампициллином, хромогенным субстратом X-gal и индуктором ИПТГ вырастают бактериальные колонии двух типов. Колонии с голубой окраской будут содержать «пустой» вектор, а обычные «белые» колонии - рекомбинантную ДНК. В каждой колонии ~ 10⁴-10⁵ клеток.

Гибридные молекулы ДНК называют рекомбинантными молекулами, потому что объединение клонируемой и векторной ДНК является не чем иным, как рекомбинацией in vitro.

Приложение 15. Общая схема ПЦР

Примечание. Приведён только первый цикл ПЦР. Первая одноцепочечная молекула ДНК строго определённого размера, от 5’-концевого нуклеотида одного праймера до нуклеотида, комплементарного 5’-концевому нуклеотиду другого праймера, появляется только после второго цикла. Первая двухцепочечная молекула ДНК такого размера - после третьего цикла. Затем ПЦР-продукт, или ампликон, с определённым числом пар нуклеотидов начинает накапливаться в последующих циклах. Ампликон имеет фиксированный размер, поскольку матрица теперь ограничена, её дальнейшее сканирование ДНК-полимеразой невозможно и матричный синтез биополимера обрывается.

В результате этой ферментативной реакции из единичных молекул ДНК-мишени синтезируется de novo в микрограммовых количествах и в миллионах копий определённая ДНК, или амплификат. Другими словами, происходит селективная амплификация ДНК in vitro (англ. amplify - увеличивать, расширять). In vivo миллион копий ДНК получается за миллион митозов.

Теоретический предел обнаружения ДНК с помощью метода ПЦР (одна молекула) и практический минимум фактически совпадают, либо находятся близко один от другого. Для сравнения: иммуноферментный анализ на присутствие патогенного микроба требует биоматериала, по меньшей мере, из сотни клеток.

Приложение 16. Сравнение аминокислотных последовательностей НАДН-дегидрогеназы гадюки Никольского и гадюки обыкновенной

Примечание. Приведены результаты попарного выравнивания (alignment) аминокислотных последовательностей НАДН-дегидрогеназы двух видов гадюк. Верхняя строка Vipera nikolskii, нижняя строка Vipera berus. Программа FASTA3x.

Выявляется 6 различий среди 256 сравниваемых аминокислотных остатков (76% от полной аминокислотной последовательности белка). Так, в позиции № 62/85 у гадюки Никольского стоит серин (S), в то время как у обыкновенной гадюки - аспарагин (N, различие Ser:Asn). Другие различия — Ala:Thr (поз. 120), Ser:Asn (поз. 123), Tyr:Thr (поз. 179), Ile:Leu (поз. 196), Ile:Thr (поз. 222).

Результаты сравнения опровергают мнение некоторых учёных о том, что гадюка Никольского является всего лишь чёрной формой гадюки обыкновенной. Это утверждение вступает в противоречие с данными молекулярного анализа важнейших биополимеров клетки: накопившиеся различия в митохондриальном белке у этих гадюк - результат их обособленной эволюции.

Приложение 17. Некоторые соотношения между размером, количеством, оптической плотностью и молярной концентрацией для белков

Конверсия: масса/моли

Конверсия: ДНК/белок

А₂₈₀ некоторых белков с концентрацией 1 мг/мл