Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Анализ концевых групп и ступенчатая деградация белков и пептидов
Деградация белков с помощью ФТЦ

Белок, растворенный в гуанидинхлориде, реагирует с ФТЦ и в кислой среде происходит циклизация и отщепление N-концевой аминокислоты, которую можно экстрагировать, а затем определить как ФТГ-производное.

МЕТОДИКА

100 мг белка растворяют или суспендируют в 5 мл дистиллированной воды, добавляют равный объем двоксана и в автотитраторе доводят pH до 8,7—8,8 0,1 М NaOH. К раствору (или суспензии), постоянно перемешивая его, при комнатной температуре добавляют 0,5 мл ФТЦ; при этом следят за тем, чтобы pH смеси оставался постоянным.

После образования ФТК-белка (около 2 ч) смесь экстрагируют сначала циклогексаном, затем бензолом и в заключение высушивают. Сухой препарат, освобожденный от бензола, растворяют в 3 мл раствора гуанидинхлорида (1 г/мл) и экстрагируют эфиром несколько раз до тех пор, пока экстинкция экстракта при 270 нм не станет практически равна нулю. Затем к раствору белка в гуанидинхлориде добавляют 1 мл 6 н. НСl и за процессом циклизации наблюдают в спектрофотометре. ФТГ-производное экстрагируют эфиром, свободным от перекисей (лучше всего это делать в аппарате Сокслета).

Эфирный экстракт содержит ФТГ-производное N-концевой аминокислоты. Пептид, находящийся в водной фазе с гуанидинхлоридом после добавления диоксана и ФТЦ может быть снова подвергнут деградации.

ПРИМЕЧАНИЯ

Недостаток реакции деградации с ФТЦ заключается в том, что её продукт — ФТК-производное — плохо растворим в воде. Применение гуанидинхлорида лишь частично снимает это затруднение — в данных условиях выход все равно невелик, что может быть причиной плохой воспроизводимости. Для преодоления этих трудностей были предложены две модификации метода: с использованием полосок фильтровальной бумаги [6] или с использованием целлюлозного порошка [3]. Однако ни одна из них существенно не улучшает метода.