Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Анализ концевых групп и ступенчатая деградация белков и пептидов
Анализ последовательности аминокислот в пептидах методом Эдмана в дансильном варианте

После удаления N-концевой аминокислоты пептида, анализируемого по методу Эдмана, N-конец оставшейся полипептидной цепи можно определить дансильным методом. На следующем этапе отщепляют новую концевую аминокислоту и снова определяют N-конец остатка. Благодаря очень высокой чувствительности дансильного метода при наличии 0,1 мкмоля пептида можно с достаточной достоверностью идентифицировать 10—15 аминокислот.

Раствор, содержащий необходимое для анализа количество пептида, наливают в ампулу со шлифом и высушивают. Затем материал растворяют в 0,15 мл воды и добавляют 0,15 мл пиридина, содержащего 5% ФТЦ. Через гетерогенную реакционную смесь пропускают струю азота, затем ампулу запаивают и помещают в термостат на 60 мин при 40° С. После инкубации смесь высушивают в предварительно нагретом до 60°С вакуумном эксикаторе над NaOH и P₂O₅, помещая эксикатор после откачивания воздуха в термостат при 60°С. После высушивания к остатку добавляют 0,2 мл безводной трифторуксусной кислоты и помещают пробирку на 30 мин в термостат при 45°С. Затем смесь высушивают в вакууме, сухой остаток суспендируют в 0,2 мл дистиллированной воды (образуется мутная суспензия) и экстрагируют бутилацетатом 3 раза по 1,5 мл. Водную фазу высушивают в предварительно нагретом эксикаторе, и сухой остаток вновь растворяют в 0,15 мл воды. Раствор содержит укороченный пептид; из него отбирают пробу для анализа концевой аминокислоты и после этого определения вновь проводят деградацию.

Точно придерживаясь рекомендуемой продолжительности обработки и используя предварительно нагретый эксикатор, можно закончить одну ступень деградации, включая определение концевой группы, за один рабочий день.

При работе методом Эдмана очень важно тщательно высушивать препарат, а также полностью удалять трифторуксусную кислоту, поскольку следы кислоты мешают нейтрализовать раствор и обеспечить оптимальную величину pH. Это ведет к мгновенному гидролизу ДНС-С₁, который не успевает прореагировать c a-NH₂-гpyппами. Если после гидролиза выявляется лишь ДНС-ОН, то дансилирование следует повторить, особенно внимательно контролируя pH. На закисление среды указывает выделение пузырьков газа; если оно происходит, следует сразу же проверить pH и в случае необходимости нейтрализовать раствор, добавив бикарбонат.

Применяя дансил-эдмановскую методику, нужно соблюдать особые предосторожности при исследовании пептидов, в которых два остатка Асп следуют друг за другом. Поскольку Асп не всегда отщепляется количественно, можно ошибочно идентифицировать последовательность Асп-Асп. Иногда Гли освобождается вместе с предшествующим аминокислотным остатком, и это может привести к тому, что Гли останется незамеченным в ходе анализа.