Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976
Газохроматографический анализ производных аминокислот. Состояние проблемы. Возможности и ограничения метода
Проблемы количественного анализа аминокислот
Количественный анализ аминокислот методом ГХ представляет несомненный интерес. Как правило, количественное определение аминокислотного состава пептида является одним из решающих моментов анализа последовательности. Поскольку при деградации крупного белка образуется большое число фрагментов, желательно затрачивать на анализ каждого из них минимальное количество времени и вещества. Привлечение в данном случае ГХ достаточно хорошо удовлетворяет этим условиям. Многочисленные исследования по ГХ аминокислот в конечном итоге направлены на решение этой задачи. Однако к действительно эффективному количественному методу предъявляются несоизмеримо более высокие требования, чем к качественному. Если учесть к тому же трудности получения и разделения производных аминокислот, станет ясно, почему до сих пор не разработан стандартный метод их количественного определения с помощью газового хроматографа. Основные трудности связаны, как подчеркивалось в разделе о получении производных, с полифункциональными аминокислотами. Метод, игнорирующий их идентификацию, может найти лишь ограниченное применение. Количественный анализ только простых аминокислот не может удовлетворять экспериментатора [40]. Вопрос о том, все ли аминокислоты, встречающиеся в белках, можно определять ГХ с достаточной точностью, все еще остается открытым. Здесь можно только вкратце рассмотреть имеющиеся условия и возможности. Проблемы, связанные с аппаратурой, необходимой для количественной ГХ, уже обсуждались ранее (см. стр. 302).
Целью количественного аминокислотного анализа является определение молярного состава пептида, т. е. типа и количеств входящих в него аминокислот. Выражение молярных отношений аминокислот путем сопоставления содержания данной аминокислоты с соответствующим значением аминокислоты, присутствующей в смеси в наименьшем количестве, хотя и дает верную картину общего состава исходного соединения, не позволяет получить информации о размере, т. е. длине полипептидной цепи. Для этого нужно определить количество хотя бы одной из аминокислот и отнести его к количеству взятого пептида. Естественно, такое определение имеет смысл только при условии, что все аминокислоты, составляющие пептид, обнаруживаются с одинаковой точностью. В таком случае можно работать с одним или несколькими внутренними стандартами, имеющими подходящие удерживаемые объемы, и находить индивидуальные поправочные коэффициенты, специфичные для определяемых производных аминокислот и, как уже упоминалось, в сильной степени зависящие от типа детектора [45, 48].
Пики, получаемые в так называемых специфичных детекторах, не отражают структурных отличий компонентов. Эти детекторы реагируют только на одну группу, присутствующую во всех производных. При регистрации метиловых эфиров ДНФ-аминокислот электронозахватным детектором наблюдали лишь очень небольшие зависящие от структуры изменения сигнала [54]. Этот детектор специфически реагирует на ДНФ-группу аминокислотных производных. Другой метод измерения, доступный лишь в исключительных случаях, основан на общем превращении различных аминокислот в одно соединение, например метан [3].
Для количественного определения аминокислот в отличие от обычной количественной ГХ важно парциальное содержание в смеси не аминокислотного производного, а исходной аминокислоты. Ошибки всех операций, проводимых перед разделением и идентификацией, оказываются включенными в общую ошибку конечного аналитического результата. Поэтому превращение аминокислот должно быть количественным или по крайней мере количественно воспроизводимым. Большие различия в выходах, даже если они воспроизводимы, заведомо усложнят работу и сделают ее чрезвычайно трудоемкой. Как показано при исследовании образования бутиловых эфиров ТФА-аминокислот, средние выходы для определенных аминокислот почти не отличались друг от друга и составляли около 96% [16, 53]. Однако при получении летучих ТФА-метиловых эфиров Ала, Гли и Вал происходили значительные потери вещества даже при аккуратном концентрировании образцов [19, 53]. Если для аминокислотного анализа выбраны производные с высокой летучестью, подобных операций лучше избегать.
Естественно, большое влияние на результаты анализа оказывает способ хранения и внесения образца. В связи с тем, что не которые аминокислоты чувствительны к гидролизу, необходимы особые предосторожности [19, 53]. Однако прежде всего для анализа смесей аминокислот требуются унифицированные экспериментальные условия превращения аминокислот. Судя по бросающимся в глаза противоречиям в опубликованных данных, эта проблема еще не решена.
Воспроизводимость пиков на газовой хроматограмме определяется поведением компонентов на колонке. Несомненно, что именно здесь кроется одна из самых серьезных проблем количественной ГХ. Как известно, частичное разложение и явления адсорбции (образование “хвостов”) в определенной степени мешали анализу многих полифункциональных органических соединений [36]. Об аналогичных наблюдениях, касающихся производных аминокислот, мы уже упоминали [19, 53, 78]; измерения Крукшенка и Шиэна [16] также не дали удовлетворительных результатов. Для всех 20 проанализированных аминокислот, за исключением Гис и Цис, разброс по величине пиков составлял менее 10%. Однако лишь для 10 аминокислот эти величины были менее 5%. При аналогичных измерениях Ламкин и Герке [53] получили значительно лучшие результаты, но они исследовали меньшее число аминокислот и провели меньше экспериментов. Следует отметить несомненное преимущество прямого внесения образца на колонку, использованного этими авторами. Впоследствии Шталлинг и др. [83] описали количественный ГХ-анализ всех природных аминокислот.
Наконец, следует подчеркнуть, что как для количественного превращения и разделения аминокислот, так и для хорошей воспроизводимости сигналов с достаточной точностью необходима в первую очередь соответствующая калибровка. При этом площади пиков можно было бы непосредственно и надежно сопоставлять с количеством микромолей аминокислот. О ценности методики можно судить только после ее применения для анализа подходящего пептидного гидролизата и сравнения с результатами, полученными другими методами.