Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976
Анализ белков с помощью низковольтного электрофореза
Электрофорез в крахмальном геле
Вертикальный электрофорез в крахмальном геле
Принцип метода. Под влиянием электрического поля происходит миграция белков в крахмальном геле.
Область применения. Изучение белков сыворотки, липо- и гликопротеидов, белковых гормонов, гемоглобинов, тканевых белков и т. д.
ПРИБОРЫ
1. Прибор для электрофореза, предложенный Смитисом в 1955 г. [26]. На фиг. 7 представлена схема прибора для вертикального электрофореза в крахмальном геле. Вертикально расположенная ванна, в которой находится крахмальный гель, имеет размер 6,5 х 20 х 250 мм. Буферный раствор заливают в резервуары 1 и 2, разделенные перегородкой из плексигласа на два отсека. В наружном отсеке каждого резервуара находятся угольные или платиновые электроды. Оба отсека в каждом резервуаре, а также буферный раствор и крахмальный гель соединяются между собой влажными полосками фильтровальной бумаги.
2. Источник тока: см. стр. 46.
Фиг. 7. Прибор для электрофореза в крахмальном геле (по Смитису [26]).
1, 2, 3 — резервуары для буферного раствора; 4 — пластмассовая ванна; 5 — крахмальный гель; 6 — место нанесения образца.
МЕТОДИКА
1. Приготовление буферного раствора. Для крахмального геля готовят боратный буферный раствор 0,03 М H3BO3 в 0,012 н. NaOH, а для заполнения камер прибора используют буферный раствор, содержащий 0,3 М Н3ВО3 и 0,06 н. NaOH.
2. Приготовление крахмального геля. Навеску картофельного крахмала суспендируют в 3 объемах воды, тщательно перемешивают и оставляют на 30 мин для отстаивания. Надосадочную жидкость, в которую переходят из крахмала растворимые примеси, отбрасывают. Отмывание крахмала отстаиванием повторяют дважды, затем осадок переносят в воронку Бюхнера и 3—4 раза промывают буферным раствором. После этого делают пастоподобную смесь крахмала с буферным раствором и примерно 100 мл этой пасты переносят в коническую колбу емкостью 0,5 л. Постоянно размешивая, крахмальную пасту нагревают до получения абсолютно гомогенной массы, причем следует избегать кипения геля. Чтобы удалить пузырьки воздуха, в колбе, содержащей нагретый гомогенный крахмальный гель, с помощью вакуумного насоса создают разрежение, и гель на 1—2 мин вскипает. После этого им заполняют ванну прибора для электрофореза; избыток буферного раствора удаляют с помощью толстой фильтровальной бумаги, а для того чтобы предотвратить испарение, поверхность геля заливают тонким слоем расплавленного парафина.
3. Соединение внутренней электрической цепи прибора. Крахмальный гель в вертикально расположенной ванне и буферный раствор, заполняющий резервуары 1 и 2, а также буферный и электродный отсеки в каждом резервуаре соединяются между собой бумажными мостиками. Каждый мостик состоит из 10 полосок фильтровальной бумаги, смоченной буферным раствором.
4. Внесение исследуемого образца. На расстоянии 7 см от катодного конца крахмального блока отмечают место внесения образца и в парафиновой пленке прорезают окошко размером 10 х 3 мм. Затем удаляют лежащий под парафином слой крахмального геля так, чтобы получился желобок, в который и вносится исследуемый материал. Очень удобно можно сделать этот желобок с помощью приспособления, изображенного на фиг. 8. Оно представляет собой стальную рамку с острыми краями 1, которую, надавливая, погружают в крахмальный гель; попадающий при этом в ее внутреннюю полость кусочек геля удаляют. 0,05 мл сыворотки тщательно размешивают с сухим крахмалом, который берут в таком количестве, чтобы получилась однородная паста такой же консистенции, как и сам гель. При помощи “плунжерной” части 2 приспособления эту пасту вносят в желобок. Удалять рамку следует очень осторожно, стараясь не повредить целостность геля. После этого окошко в парафиновой пленке закрывают новым слоем расплавленного парафина.
Фиг. 8. Приспособление, с помощью которого делают желобок для внесения образца в крахмальный блок (описание см. в тексте).
5. Электрофорез. Электрофорез в крахмальном геле продолжается 14—18 ч при градиенте напряжения 6 В/см.
6. Локализация белковых фракций. Закончив электрофорез, ванну с крахмальным гелем извлекают из прибора и располагают горизонтально на столе. Пленку парафина, закрывающую гель, удаляют, и всю поверхность крахмала покрывают листом фильтровальной бумаги. Лист плотно прижимают к поверхности геля в течение 5 мин, затем снимают его, высушивают в сушильном шкафу при 100° С и окрашивают белковыми красителями (см. стр. 54). Этим способом удается установить локализацию фракций, не прибегая к окрашиванию самого крахмального геля (метод отпечатков).
7. Элюирование белковых фракций. Используя окрашенный бумажный отпечаток, отмечают границы каждой фракции на крахмальном блоке. Острым лезвием по этим границам делят гель на фрагменты. Каждый фрагмент крахмального геля отдельно суспендируют в 10 мл холодной дистиллированной воды, частицы крахмала осаждают центрифугированием при 2000 об/мин и в надосадочной жидкости определяют содержание белка.