Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Методы средне- и высоковольтного электрофореза

М. ШАЙГО

Электрофорез на бумаге весьма часто применяют для разделения пептидов и качественного анализа аминокислот. Принцип, по которому классифицируются аппараты для электрофореза, обычно учитывает либо используемое напряжение, либо расположение листа бумаги в пространстве.

Аппаратом для средневольтного электрофореза называют прибор, обеспечивающий градиент напряжения от 20 до 40 В/см. К достоинствам таких приборов относится сравнительно умеренное теплообразование при электрофорезе. Даже если камера изготовлена из плохо проводящего тепло плексигласа, при электрофорезе данного типа можно обойтись простым водяным охлаждением. В то же время плексиглас настолько легко обрабатывается, что одну из существенных деталей прибора, а именно, охлаждающую плиту (см. ниже), можно изготовить в любой хорошо оснащенной подсобной мастерской.

Аппараты для высоковольтного электрофореза обеспечивают градиент напряжения от 50 до 100 В/см. В них специальное охлаждение становится обязательным. В горизонтальных камерах оно осуществляется с помощью металлической охлаждающей плиты, а в вертикальных — с помощью эффективного контакта с органическими растворителями.

Однако в ряде случаев, чтобы добиться необходимого разделения в аппаратах для средневольтного электрофореза, требуется значительно увеличивать продолжительность опыта. Этот недостаток в известной мере обесценивает ту легкость, с которой эти приборы можно изготовить даже в самой простой мастерской. С увеличением продолжительности электрофореза возрастает эффект диффузии, и границы зон теряют свою четкость. В то же время высоковольтный электрофорез при градиенте напряжения 50—100 В/см позволяет примерно в 2 раза сократить продолжительность опыта, что уменьшает диффузию и увеличивает четкость зональных границ.

С помощью электрофореза на бумаге можно выделять препаративные и идентифицировать малые количества аминокислот. Кроме того, электрофорез на бумаге лежит в основе анализа сложных пептидных смесей, например ферментативных белковых гидролизатов, методом “отпечатков пальцев”. Анализируемый этим методом препарат подвергается комбинированному электрофоретическому и хроматографическому разделению или комбинированному электрофоретическому разделению при разных значениях pH, причем как в том, так и в другом варианте разделение проводят в двух направлениях под прямым углом друг к другу.

Для упрощения переноса исследуемого материала из одной системы разделения в другую предложен прием “пришивания”, который используют при электрофорезе на бумаге, анализируя пептидные карты. Участок фильтровальной бумаги, содержащий фракцию исследуемого материала, выделенную хроматографией или электрофорезом, вырезают и затем пришивают на швейной машине к новому листу фильтровальной бумаги. Этим приемом устраняется необходимость элюирования, которое обычно сопровождается нежелательными потерями материала. Фактически можно ограничиться элюированием только на конечном этапе очистки.

Перенос материала с помощью пришивания, а также использование специфических химических реакций с некоторыми боковыми группами аминокислотных остатков позволили разработать особый метод электрофореза, так называемый диагональный электрофорез. С его помощью можно довольно легко выделять пептиды, имеющие в своем составе цистеин, цистин, метионин, гистидин или лизин.