Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Методы средне- и высоковольтного электрофореза
Метод диагонального электрофореза
Выделение пептидов, содержащих метионин

Полипептидные цепи можно избирательно разрушить по остаткам метионина с помощью бромциана. Разумеется, анализ полученной смеси не позволит восстановить последовательность фрагментов в исходной полипептидной цепи. Однако такого рода избирательное расщепление оказывает существенную помощь в изучении первичной структуры. Если определить небольшое число остатков с N- и С-концов бромциановых пептидов и если после ферментативного или химического гидролиза удается выделить пептиды, содержащие метионин, и затем определить их аминокислотную последовательность, то на основании всех этих данных можно расположить в правильном порядке все фрагменты пептидной цепи, полученные при расщеплении бромцианом.

Пептиды, содержащие метионин, можно выделить методом диагонального электрофореза. В основе метода лежит специфическая реакция метионина с иодацетамидом в кислой среде; в результате образуется карбамоилметилсульфониевая соль метионина (КМ-метионин).

В этой реакции происходит окисление серы и суммарный заряд пептида изменяется на + 1 единицу:

Методика диагонального электрофореза аналогична процедуре, проиллюстрированной на фиг. 22. Неполный гидролизат, содержащий пептиды с метионином, подвергают электрофорезу. После окрашивания контрольной полоски вырезают аналитическую электрофореграмму, смачивают ее 0,1 М раствором иодацетамида в пиридин-ацетатном буферном растворе с pH 3,5 [пиридин—уксусная кислота—вода (1:10:90)]. Смачивание производят осторожно распылителем или пипеткой. Необходимо, чтобы бумага пропиталась полностью, но не содержала избытка влаги. Влажную полоску на 14—16 ч помещают в эксикатор при комнатной температуре. На дно эксикатора наливают буферный раствор pH 3,5 для создания соответствующей атмосферы. Необходимо следить, чтобы в эксикаторе части бумажной полоски не соприкасались друг с другом. После инкубации электрофореграмму высушивают на воздухе и избыток иодацетамида удаляют отмыванием в ацетоне, 3—4 раза погружая в него полоску. Сухую полоску пришивают к новому листу фильтровальной бумаги и подвергают электрофорезу, используя тот же самый буферный раствор, который применялся при первом электрофорезе, но проводя разделение под прямым углом к первоначальному направлению. Пептиды, содержащие метионин, благодаря изменению суммарного заряда на +1 единицу сместятся в сторону катода от диагонали, по которой располагаются другие пептиды.

Последовательность аминокислот, выделенных таким путем в пептидах, содержащих КМ-метионин, можно анализировать затем обычными методами. Кроме того, можно произвести избирательное расщепление таких пептидов. Если их в течение 2 ч инкубировать при 100°С в запаянной ампуле, произойдет расщепление по остаткам метионина с превращением их в гомосерин или в гомосеринлактон.