Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Методы средне- и высоковольтного электрофореза
Метод диагонального электрофореза
Выделение пептидов, содержащих гистидин

При pH 6,0 остатки гистидина в полипептидных цепях специфически реагируют с диэтилпирокарбонатом, в результате чего они превращаются в остатки карбэтоксигистидина [7]. Образовавшийся остаток карбэтоксигистидина не может быть протонирован, т. е. карбэтоксилирование сопровождается потерей заряда этим остатком. В щелочной среде карбэтоксильная группа освобождается и вновь появляется гистидин. Это обратное превращение карбэтоксигистидина в гистидин приводит к увеличению суммарного заряда молекулы на +1 единицу. Реакция карбэтоксилирования в первую очередь имеет значение при анализе остатков гистидина, играющих прямую или косвенную роль в функционировании нативных белков. Использование этой реакции в диагональном электрофорезе позволяет выделить из ферментативного гидролизата такого белка пептиды, имеющие в своем составе модифицированные остатки гистидина.

Исследуемый белок растворяют в фосфатном буферном растворе pH 6,0 и, добавляя свежеприготовленный раствор диэтилпирокарбоната в этаноле, проводят карбэтоксилирование. Соотношение гистидин/диэтилпирокарбонат должно составлять 1:10. Рассчитанное, исходя из этого соотношения, количество диэтилпирокарбоната разбавляют в 5 раз этанолом. После инкубации в течение 1 ч, во время которой, кроме карбэтоксилирования, происходит также разрушение избытка диэтилпирокарбоната, раствор белка необходимо обессолить гель-фильтрацией или диализом. Число связанных карбэтоксильных групп можно определить спектрофотометрически; их коэффициент молярной экстинкции при 240 нм равен 3 260 [9].

Затем карбэтоксилированный белок гидролизуют каким-либо ферментом, функционирующим в интервале pH от 6 до 8. Вне этого интервала карбэтоксильные связи нестабильны. Удобнее всего вести гидролиз в автотитраторе при тщательном перемешивании и непрерывном добавлении щелочи, поддерживая pH смеси на постоянном уровне и не допуская локального защелачивания.

Ферментативный гидролизат лиофилизируют и затем подвергают электрофорезу. При pH 5 гистидин полностью ионизирован, поэтому наибольшего различия в электрофоретической подвижности между пептидами, содержащими гистидин и карбэтоксигистидин, следует ожидать именно в этих условиях. В связи с этим электрофорез обычно проводят при pH 5. После окрашивания контрольной полоски вырезают аналитическую электрофореграмму, помещают ее в эксикатор над 5 н. раствором аммиака и инкубируют при комнатной температуре 6 ч.

После инкубации электрофореграмму высушивают и снова подвергают электрофорезу при pH 5 в перпендикулярном направлении. В парах аммиака происходит отщепление карбэтоксильных групп, гистидиновые остатки становятся доступными протонированию, и при электрофорезе пептиды, содержащие гистидин, смещаются от занимаемого другими пептидами диагонального положения в сторону катода.

Установив с помощью аналитического диагонального электрофореза локализацию зоны пептидов с гистидином на препаративной электрофореграмме, ее вырезают и после обработки парами аммиака вновь подвергают электрофоретическому разделению в препаративном масштабе.