Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Методы средне- и высоковольтного электрофореза
Метод диагонального электрофореза
Выделение пептидов, содержащих лизин

Анализ пептидов, содержащих лизин, из ферментативного (но не триптического!) или частичного химического гидролизата является важным этапом расшифровки аминокислотной последовательности белков. Выделение пептидов, содержащих лизин, следует начать с обратимого блокирования ε-аминогрупп остатков лизина в исследуемом белке. Такую обратимую модификацию можно получить при трифторацетилировании [5], малеинировании [2] или цитраконилировании [4].

Перед трифторацетилированием SH-группы исследуемого белка карбоксиметилируют или окисляют надмуравьиной кислотой. 100 мг белка растворяют в 10 мл 8 М раствора мочевины и к этому раствору при тщательном перемешивании в три приема добавляют 3 мл этилтиотрифторацетата, поддерживая pH около 10 с помощью 5 н. раствора NaOH. После внесения последней порции этилтиотрифторацетата pH понижают до 6 и удаляют мочевину и избыток реагента, диализуя смесь против дистиллированной воды или 1%-ного раствора бикарбоната аммония. В результате трифторацетилирования ε-аминогруппы остатков лизина блокируются трифторацетильными группами, и поэтому они не могут быть протонированы. Далее модифицированный белок подвергают ферментативному гидролизу, следя за тем, чтобы pH не превысил 8,2, так как в более щелочной среде трифторацетильные группы отщепляются. Гидролизат подвергают электрофоретическому разделению, затем из электрофореграммы вырезают полоску для аналитического диагонального электрофореза и помещают ее на 4 ч в эксикатор над 5 н. раствором аммиака. В щелочной среде происходит отщепление трифторацетильных групп и регенерация ε-аминогрупп, которые вновь становятся доступными протонированию. В результате протонирования заряд каждого остатка лизина изменяется на +1 единицу. Поэтому при электрофорезе происходит смещение пептидов, содержащих лизин, от диагонального положения остальных компонентов по направлению к катоду [10].

Обратимое блокирование ε-аминогрупп можно также получить в результате реакций малеинирования или цитраконилирования. В этих реакциях происходит включение карбоксильной группы в ε-аминогруппу с изменением ее заряда.

Для малеинирования исследуемый белок растворяют в 8 М мочевине, содержащей 0,1 М пирофосфата, до концентрации 10 мг/мл. В этот раствор вносят одну каплю фенолфталеина и в три приема добавляют 30 молярных эквивалентов чистого малеинового ангидрида (в расчете на количество аминогрупп), тщательно перемешивая раствор. Непрерывно подавая 10%-ный раствор NaOH, pH этой смеси постоянно поддерживают в зоне перехода окраски фенолфталеина. По окончании реакции (через 10—12 мин) мочевину удаляют диализом против дистиллированной воды или гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-25 (крупнозернистый).

Реакцию цитраконилирования проводят так же, как и реакцию малеинирования, в 8 М растворе мочевины, содержащем 10 мг/мл белка, в автотитраторе. Величина pH поддерживается на постоянном уровне с помощью непрерывной подачи 10%-ного раствора NaOH. К раствору белка в три приема при тщательном перемешивании прибавляют 30 молярных эквивалентов цитраконового ангидрида (в расчете на количество аминогрупп). В конце реакции смесь обессоливают диализом или гель-фильтрацией.

Для ферментативного гидролиза малеинированных и цитраконилированных белков можно использовать почти все протеолитические ферменты, за исключением пепсина, оптимум действия которого находится при кислом pH. Частичный кислотный гидролиз в данном случае также не пригоден. После ферментативного гидролиза проводят препаративный электрофорез, затем вырезают полоску для аналитического диагонального электрофореза и помещают ее в вакуумный эксикатор. Если анализируется малеинированный белок, то в эксикаторе находится буферный раствор, состоящий из 1%-ного пиридина и 5%-ной уксусной кислоты; в эксикаторе создается вакуум и его помещают на 16 ч в термостат при 60°С. Если анализу подвергается цитраконилированный белок, то в эксикаторе содержится 0,05 М уксусная кислота, и после создания вакуума его помещают в термостат при 37°С на 6 ч. После инкубации полоски высушивают, пришивают к новым листам фильтровальной бумаги и подвергают электрофорезу в направлении, перпендикулярном первоначальному. При отщеплении ацильных групп происходит регенерация аминогрупп, имеющих заряд +1. Поскольку блокирующая карбоксильная группа имела заряд —1, то после удаления блокирующего агента происходит суммарное увеличение заряда на +2 единицы. Такое изменение заряда приводит к весьма значительному смещению пептидов, содержащих лизин, в сторону катода [2, 4].