Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976
Методы иммунохимического анализа
Получение иммунной сыворотки
Схемы иммунизации с адъювантами
А. Адсорбция антигена на гидроокиси алюминия: адсорбция белкового антигена на геле гидроокиси алюминия значительно увеличивает его иммуногенность.
В нашей лаборатории гидроокись алюминия используется при иммунизации кроликов для получения антисыворотки к сывороточным белкам человека (например, для иммуноэлектрофоретических исследований). Ниже описывается способ получения антисыворотки.
Приготовление антигена заключается в смешивании следующих компонентов: 6,25 мл сыворотки человека (берется смесь сывороток нескольких доноров), 12,5 мл 0,9%-ного раствора NaCl, 5,0 мл геля гидроокиси алюминия, 1,25 мл 5%-ного раствора фенола. 2,5 мл этой смеси вводят внутримышечно животным в два места раз в неделю в течение 6 нед. Через неделю после последней инъекции у кролика берут кровь и определяют титр антител. Если титр сыворотки еще не достиг необходимой величины или если с ее помощью нельзя выявить желаемого числа антигенных компонентов, еженедельные инъекции повторяют до получения нужного эффекта.
Б. Существенную помощь при получении антисыворотки оказывает адъювант Фрейнда [7]. Необходимое количество белкового антигена (например, 500 мг овальбумина) растворяют в 10 мл физиологического раствора хлористого натрия, содержащего 1% фенола. К раствору антигена добавляют 10 мл одного из имеющихся в продаже эмульгаторов, производных ланолина (аквафор фирмы Duke Lab., фальба фирмы Pfaltz and Bauer Inc. N. Y.; безводный ланолин), и смешивают их в гомогенизаторе Уоринга. К полученному гомогенату добавляют 20 мл жидкого парафина, содержащего 50 мг равномерно суспендированных лиофилизированных микобактерий туберкулеза, убитых нагреванием. После повторной гомогенизации 1 мл полученной смеси, подогретой перед инъекцией до 37°С, вводят животным внутримышечно или подкожно трижды с недельным интервалом.
В продаже имеются готовые препараты полного и неполного адъюванта Фрейнда. Весьма хорошо себя зарекомендовала следующая схема иммунизации белковыми антигенами. 0,1—1,0 мг антигена растворяют в 0,25—0,5 мл физиологического раствора хлористого натрия и гомогенизируют с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Эмульсию вводят внутримышечно в четыре места. Спустя 3—4 нед у животного берут кровь и определяют активность антисыворотки в иммуноэлектрофорезе. При необходимости эту процедуру повторяют. Если через 2—3 нед после повторной иммунизации специфическая активность антисыворотки окажется недостаточной, то делают дополнительные еженедельные внутримышечные инъекции 5—10 мг белкового антигена без адъюванта до тех пор, пока титр антител не достигнет нужной величины.
ПРИМЕЧАНИЯ
1. Приготовление геля гидроокиси алюминия. Растворы: а) 11,0 г сернокислого аммония растворяют в дистиллированной воде, доводят конечный объем раствора до 300 мл и подогревают до 63°С;
б) 38,35 г алюминиево-калиевых квасцов растворяют в 500 мл дистиллированной воды и подогревают раствор до 58°C.
Раствор сернокислого аммония смешивают с раствором квасцов (1:2), с помощью NaOH доводят pH полученной смеси до 6,5, затем нагревают до 61°С и оставляют при этой температуре на 10 мин. Как только закончится образование и оседание хлопьев, смесь центрифугируют и осадок трижды отмывают дистиллированной водой, в которую добавлено несколько капель аммиака. Отмытый осадок суспендируют в дистиллированной воде до нужной концентрации.
2. После того как в ходе иммунизации активность сыворотки, которую измеряют, отбирая пробы, достигнет нужной величины, животным-продуцентам делают кровопускание для получения максимального количества сыворотки. Если иммунная сыворотка получена в нестерильных условиях, в нее рекомендуется добавить мертиолат в соотношении 1:5000. При хранении в холодильнике (по возможности в замороженном состоянии) активность полученных антисывороток может сохраняться в течение нескольких лет.
Если курс иммунизации животного-продуцента не закончился тотальным кровопусканием, то через некоторое время ему можно сделать повторную “напоминающую” инъекцию антигена в той же дозе и тем же способом, а через 7—9 дней можно взять кровь и получить иммунную сыворотку.
3. Иммунная сыворотка, используемая в реакциях преципитации, должна иметь титр антител не менее 1:10 000.