Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Ионообменная хроматография пептидов
Хроматография основных пептидов на колонке с амберлитом IRC-50

Принцип метода. Основные пептиды связываются катионообменной смолой амберлит IRC-50 (Н⁺), а затем могут быть элюированы при повышении концентрации Н⁺ и тем самым отделены от нейтральных и кислых пептидов, которые не связываются смолой.

Область применения. Фракционирование пептидов при биохимических исследованиях.

МЕТОДИКА

1. Приготовление смолы. Смолу амберлит IRC-50 (200—400 меш) суспендируют в 0,2 н. уксусной кислоте, оставляют для оседания, а затем декантируют надосадочную жидкость. Влажный осадок суспендируют в 5 объемах 0,2 н. уксусной кислоты и нагревают до 60° С. Через 30 мин суспензию охлаждают, надосадочный слой декантируют и вновь повторяют прогревание в уксусной кислоте. После этого смолу отмывают дистиллированной водой (большими объемами) до нейтральной реакции.

Обработанной смолой заполняют колонку 2 х 30 см и промывают дистиллированной водой. В смеситель для градиентного элюирования заливают 150 мл дистиллированной воды, в резервуар — 0,2 н. уксусную кислоту и начинают наносить на колонку фракционируемый препарат.

2. Хроматография. Фракционируемый препарат готовят, как указано выше (см. хроматографию на амберлите IR-4B, стр. 195), подводят его pH до 5—6 и медленно наносят на колонку. После нанесения смолу промывают одним объемом дистиллированной воды, затем присоединяют прибор для градиентного элюирования, включают магнитную мешалку и начинают элюирование. Элюат собирают фракциями по 1 мл с помощью автоматического коллектора. За ходом элюирования следят по нингидриновой реакции, которую проводят на фильтровальной бумаге с каплями элюата, отбираемыми из каждой фракции.

Полученные фракции высушивают в вакуумном эксикаторе и анализируют с помощью электрофореза на бумаге. Фракции, обладающие одинаковой электрофоретической подвижностью, объединяют.

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Если элюирование основных пептидов происходит слишком быстро, т. е. они выходят практически одной большой фракцией, следует сделать градиент концентрации Н⁺ более “пологим”. Для этого можно либо увеличить объем смесителя, либо уменьшить концентрацию уксусной кислоты.

2. При промывании колонки дистиллированной водой после нанесения образца перед началом элюирования кислотой выходит весьма разбавленный элюат, содержащий нейтральные и кислые компоненты смеси пептидов.