Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976
Ионообменная хроматография пептидов
Фракционирование кислых пептидов на колонке с амберлитом IR-4B
Принцип метода. Анионообменная смола амберлит IR-4B, используемая в ацетатной форме, при значениях pH раствора между 5 и 6 связывает фракцию пептидов, обладающих сильнокислотными свойствами, которая может быть затем элюирована в обмен на ионы Cl-.
Область применения. Эта смола используется в основном для фракционирования небольших пептидов и выделения кислых аминокислот и пептидов из смеси.
МЕТОДИКА
1. Приготовление колонки со смолой. Для связывания 15 мг дикарбоновой кислоты необходимо около 3,0 г сухой смолы. Смолу (200—400 меш) суспендируют в 0,2 н. уксусной кислоте и оставляют для оседания. Неосевшие мелкие частицы смолы декантируют, а набухшую смолу суспендируют вновь, нагревают до 60° С и перемешивают в течение 1 ч. После декантации смолу 4—5 раз промывают дистиллированной водой и снова нагревают в 0,2 н. уксусной кислоте до 60° С. Смесь перемешивают в течение 1 ч, надосадочную жидкость декантируют, а смолу дважды промывают 0,2 н. уксусной кислотой. После этого суспензию отмывают дистиллированной водой до тех пор, пока pH не станет нейтральным. Приготовленной суспензией смолы заполняют колонку размером 0,5x30 см.
2. Хроматография. Фракционируемый материал растворяют с таким расчетом, чтобы 15 мг содержалось примерно в 30—40 мл растворителя, pH раствора подводят до 5—6 и раствор медленно наносят на колонку. После нанесения образца через колонку пропускают равный объем дистиллированной воды, а затем начинают элюирование 0,1 н. НСl. Скорость элюирования должна быть примерно вдвое меньше скорости нанесения фракционируемого материала. Вытекающий с колонки элюат собирают фракциями в пробирки по 1 мл. За ходом элюирования можно следить с помощью нингидриновой реакции, которую ставят с аликвотами фракций на фильтровальной бумаге: начиная с 11-ой пробирки 1 каплю каждой фракции наносят на лист бумаги Ватман 3, высушивают и проявляют 0,5%-ным раствором нингидрина в ацетоне. Элюирование продолжают до тех пор, пока в отбираемых аликвотах перестанет появляться окраска.
Полученные фракции либо высушивают в вакуумном эксикаторе над КОН или Р2О5, либо лиофилизируют.
ПРИМЕЧАНИЯ
1. Применяя градиентное элюирование, можно добиться дальнейшего разделения полученной фракции кислых компонентов.
2. Смолу регенерируют так же, как и перед заполнением колонки.
3. Элюат, полученный в результате промывания колонки дистиллированной водой после нанесения материала перед элюированием 0,1 н. НСl, содержит нейтральные и основные компоненты фракционируемой смеси пептидов.