Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976
Хроматография белков
Хроматография белков на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой
Хроматография на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой в ОН- -форме
ДЭАЭ-целлюлоза благодаря своей функциональной группе — диэтиламиноэтильному остатку — обладает свойствами слабого анионообменника. Ее используют главным образом для разделения природных высокомолекулярных полимеров, особенно чувствительных к резким изменениям pH и температуры, т. е. в первую очередь для фракционирования белков. Хроматография на ДЭАЭ- целлюлозе отличается высокой разрешающей способностью. Этот ионообменник пригоден как для аналитического, так и для препаративного фракционирования белков на колонках соответствующего размера.
а) Подготовка ДЭАЭ-целлюлозы. Перед заполнением колонки ДЭАЭ-целлюлозу обрабатывают следующим образом:
1) Необходимое количество ДЭАЭ-целлюлозы в течение 15 мин при комнатной температуре перемешивают в 5-кратном количестве 0,5 н. NaOH и оставляют для отстаивания. Неосевшие мелкие частицы ионообменника декантируют вместе с надосадочной жидкостью.
2) Несколько раз ДЭАЭ-целлюлозу отмывают дистиллированной водой до pH 8—9. Отмывание удобно проводить с помощью центрифугирования, при котором частички целлюлозы оседают гораздо быстрее и вся процедура отмывания требует меньше времени.
3) Отмытую ДЭАЭ-целлюлозу смешивают с 3-кратным количеством 96%-ного этанола, оставляют отстаиваться и затем надосадочную жидкость декантируют.
4) Обработку 0,5 н. NaOH проводят еще раз.
5) Целлюлозу отмывают дистиллированной водой до нейтральной реакции с помощью центрифугирования.
Обработанную таким образом ДЭАЭ-целлюлозу можно хранить в виде водной суспензии при 4°С. Следует избегать хранения ионообменников при комнатной температуре из-за опасности микробного заражения.
б) Выбор размера колонки. Белки со средним молекулярным весом (около 50 000) обычно разделяют на длинных узких колонках. Для фракционирования 100 мг белка на ДЭАЭ-целлюлозе емкостью 0,7—0,8 мэкв/г нужна колонка размером 1,5x35 см. В зависимости от свойств фракционируемого белка, содержания в нем примесей, способа элюирования и т. д. размеры колонки могут варьировать как по диаметру, так и по длине.
Проведя соответствующие предварительные опыты, можно рассчитать оптимальные размеры колонки для препаративного разделения больших количеств белка. Чтобы обеспечить оптимальную скорость протекания жидкости через колонку и тем самым достаточно быструю хроматографию, увеличивать объем колонки следует в первую очередь за счет увеличения ее диаметра. Ддя фракционирования 1,0 г белка со средним молекулярным весом достаточно иметь колонку 3,5 х 45 см.
в) Скорость протекания жидкости через колонку. Задаваемая скорость протекания жидкости через колонку определяется размерами данной колонки. При микропрепаративной хроматографии на колонке 1,5x35 см оптимальной является скорость 15—20 мл/ч. Препаративная хроматография на колонке большего диаметра проводится со скоростью протекания жидкости 25—30 мл/ч; при более высоких скоростях разделение ухудшается и фракции больше разбавляются.
г) Подбор условий хроматографии. Колоночную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе можно вести путем ступенчатого и градиентного элюирования. Ступенчатое элюирование целесообразно только в том случае, если фракционируемые компоненты элюируются при сильно различающихся значениях pH и молярности, т. е. когда нет опасности смешения отдельных фракций.
При любом способе элюирования оптимальные для данного материала условия хроматографии подбираются, исходя из трех уже известных альтернатив: 1) увеличение молярности элюента 2) увеличение pH элюента при постоянной молярности и 3) одновременное увеличение pH и молярности элюента.
Хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе обычно начинают в буферном растворе pH 8 невысокой молярности. Фракционируемый материал растворяют в 0,05 М буферном растворе pH 7,8—8,2 и после нанесения его на колонку ступенчато или с помощью градиента увеличивают молярность элюента сначала до 0,1, потом до 0,5 и наконец до 1,0 М.
Выбор буферного раствора определяется исключительно природой фракционируемого материала. Если хлориды не вступают с последним в реакцию, то рекомендуется проводить хроматографиюна ДЭАЭ- целлюлозе в Сl- -форме.