Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976
Хроматография белков
Хроматография белков на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой
ДЭАЭ-целлюлоза в Сl- -форме
а) Перевод ДЭАЭ-целлюлозы в Сl- -форму. ДЭАЭ-целлюлозу в ОН- -форме, обработанную, как описано выше, и суспендированную в дистиллированной воде, перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре с 3 объемами 0,05 М трис-НСl pH 8. Суспензию оставляют отстаиваться и после декантации надосадочной жидкости дважды повторяют такое перемешивание. Затем ДЭАЭ-целлюлозу суспендируют в том же буферном растворе и заполняют ею колонку соответствующих размеров так, чтобы столбик ионообменника был гомогенным и не содержал пузырьков воздуха. После заполнения колонки ДЭАЭ-целлюлозу промывают вышеупомянутым буферным раствором до тех пор, пока электропроводность и pH элюата не достигнут показателей промывающего раствора. На этой стадии колонка готова к фракционированию.
б) Хроматография нативных белков на ДЭAЭ-целлюлозе в Сl- - форме. Фракционируемый материал растворяют в небольшом объеме стартового буферного раствора (обычно 100 мг в 3—5 мл). Растворителем служит буферный раствор 0,05 М трис-НСl pH 8 (указанная молярность относится к ионам Сl-), в котором материал связывается с ионообменником. Раствор фракционируемого материала предварительно в течение 10 ч диализуют против этого же буферного раствора.
Осторожно удаляют из верхней части колонки буферный раствор над целлюлозой так, чтобы над ионообменником остался слой жидкости высотой не более 2—3 мм. Раствор фракционируемого материала осторожно наслаивают на ДЭАЭ-целлюлозу круговыми движениями руки, прикасаясь загнутым кончиком пипетки к внутренней поверхности колонки. При наслаивании важно не взбалтывать частички ДЭАЭ-целлюлозы. Нанесенный раствор входит в ионообменник, и затем остатки наносимого материала трижды смывают со стенок верхней части колонки 0,5—1,0 мл 0,05 М буферного раствора.
При 0,05 М концентрации ионов Cl- нативные белки хорошо связываются с ДЭАЭ-целлюлозой. Несвязавшиеся компоненты фракционируемой смеси удаляют, промывая колонку одним объемом буферного раствора.
в) Градиентное элюирование. Если фракционирование проводят на колонке размером 1,5x35 см, то для. элюирования достаточны сосуды объемом по 100 мл, один из которых является смесителем, а другой — резервуаром для буферного раствора. В смеситель заливают 0,1 М, в резервуар —0,5 М буферный раствор, соединяют их тефлоновой или поливинилхлоридной трубкой, свободной от пузырьков воздуха, и подключают к колонке смеситель, стоящий на магнитной мешалке.
С помощью винтового зажима на тефлоновой или поливинилхлоридной трубке на выходе колонки устанавливают оптимальную скорость протекания жидкости, равную примерно 1 мл/мин.
Элюат собирают фракциями по 0,5—1,0 мл. Если есть соответствующий прибор, то производится непрерывная спектрофотометрия и регистрация оптической плотности элюата, а полученные фракции объединяют согласно вычерченному самописцем графику. При отсутствии автоматического проточного абсорбциометра все фракции элюата спектрофотометрируют при 280 нм, строят график изменения оптической плотности и по нему отбирают нужные фракции.
Определив экстинкцию исходного материала и полученных фракций, можно установить выход препарата в результате хроматографического разделения.