Химия белка - Часть 1 - Общая химия белка - Ашмарин И. П 1968

Выделение и очистка белков
Оценка полноты очистки белков
Методы оценки полноты очистки и гомогенности белков

Полнота очистки от небелковых азотсодержащих соединений оценивается обычно по соотношению между белковым (осаждаемым 10%-ной ТХУ) и общим азотом препарата.

Большие трудности возникают при оценке степени очистки от сопутствующих белков. Если выделяемый белок обладает характерной биологической активностью, поддающейся количественной оценке, то очень полезно определение удельной активности — на единицу веса белка или белкового азота. Вычисляя затем отношение удельной активности полученного препарата к удельной активности исходного гомогената ткани, экстракта и т. п., находят так называемый коэффициент очистки.

Заключительная оценка полноты очистки и гомогенности белка требует сочетания ряда применяемых методов. Для предварительного вывода о гомогенности необходимы прежде всего данные о невозможности дальнейшего фракционирования препарата всеми применимыми в данном случае методами. Разумеется, имеются в виду не все возможные приемы, а наиболее эффективные варианты основных методов фракционирования — ультрацентрифугирования, электрофореза, хроматографии, молекулярной фильтрации и др., причем не в препаративных, а в аналитических модификациях. При этом приходится считаться с опасностью того, что выявление новых фракций может быть обусловлено частичной денатурацией белка при некоторых из этих процедур. С другой стороны, невозможность дальнейшего фракционирования может быть обусловлена недостаточным совершенством использованных разновидностей методов разделения. Нередко оказывалось, что применение более совершенных методов позволяло фракционировать белки, считавшиеся ранее гомогенными.

Важным признаком гомогенности является проба на постоянство растворимости. Она основана на том, что в одинаковых условиях растворимость чистого белка должна быть постоянной, независимо от того, какое количество этого белка присутствует в виде твердой фазы. Согласно правилу фаз (Гиббса), число степеней свободы в системе, находящейся в состоянии равновесия при постоянном давлении и температуре, связано с числом компонентов и фаз следующим уравнением:

F = C—Р,

где С — число компонентов, Р — число фаз, a F — число степеней свободы. Допустим, мы имеем раствор гомогенного белка. Тогда число компонентов С = 2 (белок + растворитель), число фаз Р = 1 и, следовательно, число степеней свободы F = 1.

Это значит, что оба компонента в такой системе могут присутствовать в любых соотношениях, совместимых с их взаимной растворимостью. Однако если рассматривать насыщенный раствор того же белка, в котором суспензировано некоторое количество нерастворившегося белка, то мы будем иметь уже двухфазную систему с числом степеней свободы, равным нулю. Это значит, что при любом соотношении фаз их состав должен быть неизменным. Следовательно, сколько бы мы ни добавляли белка к насыщенному раствору, концентрация последнего не изменится, дополнительного растворения не произойдет.

Если в серию пробирок с одинаковым количеством растворителя поместить возрастающие количества гомогенного белка, перемешать, дождаться установления равновесия в системе, отфильтровать и в фильтратах определить концентрацию белка, то зависимость последней от общего количества внесенного белка выразится ломаной линией 1, представленной на рис. 6. Отрезок AB будет соответствовать однофазной системе, а горизонтальная часть графика — двухфазной системе с насыщенным раствором белка постоянной концентрации, независимой от количества твердой фазы. Иная картина наблюдается, если мы имеем нефракционированную белковую смесь, состоящую, например, из двух компонентов. В этом случае, даже если раствор насыщен одним из компонентов, мы будем иметь двухфазную систему. Концентрация растворенного белка в ней будет изменяться при увеличении количества общего белка, хотя темп этих изменений замедлится. Этому состоянию на графике растворимости такой белковой смеси (кривая 2) будет соответствовать отрезок В'С'. Таким образом, наличие более чем одного излома на графике растворимости, или вообще более сложный характер зависимости, нежели представленный на кривой 1, является свидетельством негомогенности белка. Проба на постоянство растворимости — самый строгий тест на гомогенность. Однако применимость ее ограничена необходимостью использовать относительно большие количества очищенного белка, опасностью денатурации лабильных белков при встряхивании и медленностью растворения некоторых белков.

Рис. 6. Зависимость концентрации растворенного белка от общего количества белка в системе для гомогенного белка (1) и для смеси двух белков (2) Пояснения в тексте.

Особого упоминания заслуживает оценка гомогенности белка с помощью так называемого иммуноэлектрофореза. Сущность его состоит в сочетании двух приемов: 1) разделения белковой смеси с помощью электрофореза в геле; 2) взаимодействия полученных фракций с антисывороткой, содержащей антитела против всех компонентов исследуемой смеси. Последнее осуществляется в том же геле, где производился электрофорез, причем антисыворотка диффундирует в направлении, перпендикулярном направлению предшествующего разделения. Зоны соосаждения каждого из белков с соответствующим антителом, как правило, не совпадают (разная подвижность и растворимость комплексов белок — антитело, в результате чего они проходят разную дистанцию до момента соосаждения). В тех случаях, когда можно получить антисыворотку, преципитирующую (осаждающую) все или большинство компонентов смеси, метод является чрезвычайно эффективным. Следует, однако, иметь в виду, что получение преципитирующих сывороток применительно к многим белкам — задача весьма нелегкая, особенно если их доля в смеси невелика или если они относятся к малоиммуногенным белкам (с низким содержанием ароматических аминокислот, относительно малым молекулярным весом и др.). Это существенно ограничивает применимость иммуноэлектрофореза.

В настоящее время доказано наличие в одних и тех же клетках и тканях чрезвычайно близких белков, не вполне, однако, идентичных друг другу по составу, структуре, физикохимическим свойствам и биологической активности. Таковы, например, изоэнзимы и некоторые из белков, образующихся в результате незначительных изменений в геноме клетке или искажений процессов синтеза белка в данной клетке. Это еще больше усложняет оценку гомогенности. Даже при наличии положительных данных о гомогенности по всем перечисленным выше тестам следует считать достаточно строгим лишь вывод об очень высокой степени очистки и о большой вероятности того, что данный белок является гомогенным.