Химия белка - Часть 1 - Общая химия белка - Ашмарин И. П 1968
Пространственная организация белковой молекулы
Методика изучения вторичной структуры белков и полипептидов
Обмен дейтерия
Другим количественным методом измерения числа пептидных групп, взаимосвязанных водородными связями, является изучение кинетики изотопного обмена имидного водорода белка или полипептида на водород воды. Хотя выше прием уже излагался вкратце, на нем необходимо остановиться более подробно. Сущность этого метода сводится к следующему.
Если белок или полипептид растворяются в тяжелой воде (D2O), то их атомы водорода будут замещаться атомами D со скоростью, которая зависит от того, к каким атомам они присоединены. Известно, что очень быстро обмениваются Н- атомы, присоединенные к кислороду и азоту, в том числе и в пептидных группах, тогда как атомы, присоединенные к углероду, могут медленно обмениваться лишь при повышенной температуре. На этой основе можно теоретически рассчитать ожидаемое число быстро обменивающихся атомов водорода для данного полипептида и белка.
С другой стороны, известно, что в низкомолекулярных полипептидах имидный водород пептидной группы обменивается с водой неизмеримо быстро, тогда как у высокомолекулярных полипептидов обмен этого атома замедлен и зависит от температуры. Переход от быстрого обмена имидного водорода со средой к медленному обмену является указанием на образование внутримолекулярной водородной связи. Зная общее число быстро обменивающихся атомов имидного водорода и определив количество медленно обменивающихся атомов, мы можем узнать число внутримолекулярных водородных связей и, следовательно, степень спирализации белка.
Однако данные, получаемые этим методом, весьма относительны, поскольку сама дифференцировка быстро и медленно обменивающихся атомов водорода часто бывает затруднительной. Причина этого состоит в следующем. Известно, что благодаря образованию отдельных вторичных связей (дисульфидные мостики, взаимодействие боковых радикалов и т. п.) могут возникать напряжения на отдельных участках а-спирали, которые приводят к ослаблению водородных связей. В результате атомы имидного водорода в этих звеньях будут обмениваться несколько быстрее, нежели атомы других пептидных групп, но медленнее, чем при полном отсутствии водородных связей. Например, из 123 пептидных водородов рибонуклеазы 70 обмениваются при 0° медленно, т. е. степень спирализации можно считать равной 57%. Но из этих 70 имидных водородов, стабилизированных Н-связями, 25 способны обмениваться с водой при 0° за несколько суток, 25 дополнительно обмениваются при 38° за сутки и лишь 20 не способны обмениваться вплоть до температуры плавления а-спирали. Отсюда степень спирализации может быть оценена и в 36% (45 медленно обменивающихся Н-атомов), и в 16% (20 необменивающихся Н-атомов). Поэтому метод скорости дейтерации может быть использован для оценки степени спирализации белка лишь в совокупности с другими приемами анализа.
В заключение необходимо остановиться еще на двух методах оценки вторичной структуры полипептидов и ряда белков: электронной микроскопии и спектроскопии в инфракрасной области. Эти методы, соответственно, позволяют нам получить прямые доказательства существования а-спиралей и четко отметить тип вторичной структуры макромолекулы. Однако эти приемы исследования вторичной структуры существенно отличаются от вышеизложенных тем, что они не могут быть применены для изучения белков и полипептидов в растворе.