Химия белка - Часть 1 - Общая химия белка - Ашмарин И. П 1968

Определение величины и формы белковых молекул
Аналитическое ультрацентрифугирование
Метод скорости седиментации

В этом методе скорость вращения ротора — порядка 60 000 об/мин (обычно это соответствует 250 000 g). При этом происходит образование границы раздела между растворителем и раствором и ее передвижение ко дну ячейки. Этот метод позволяет получить представление о чистоте препарата по числу границ раздела и рассчитать константу седиментации с тем, чтобы использовать эти данные для определения молекулярного веса вещества, а также оценить изменения формы и молекулярного веса при различных превращениях молекулы и т. д.

Скорость движения границы раздела зависит от соотношения между приложенной центробежной силой и вязкостным сопротивлением среды. Существенным условием движения молекул растворенного вещества по отношению к растворителю является также разность плотностей между ними. Рассмотрим движение молекул белка на расстоянии х от центра вращения ротора при угловой скорости w (радиан/сек). Центробежное ускорение в этом случае равно w²х. Если молекулярный вес белка равен М и v — его парциальный удельный объем, то центробежная сила, действующая на молекулу, будет равняться произведению центробежного ускорения на ее эффективную массу. Последняя представляет собой разность между истинной массой молекулы m = M/N и массой растворителя вытесняемого Молекулой (р — плотность растворителя):

В начале опыта скорость белковых молекул dx/dt равна нулю. По мере увеличения скорости вязкостное сопротивление среды растет до тех пор, пока оно не сравняется с центробежной силой. При достижении такого стационарного состояния молекула начнет передвигаться в среде с постоянной скоростью. Сила сопротивления среды, равная центробежной силе, определяется уравнением

где f — коэффициент внутреннего трения. Он прямо пропорционален тепловой энергии молекулы RT (R — газовая постоянная, Т — абсолютная температура) и обратно пропорционален коэффициенту диффузии D:

При стационарном состоянии

При умножении обеих частей равенства на число Авогадро m перейдет в М:

Преобразуя это уравнение, получим:

Выражение (dx/dt)/w²х представляет скорость оседания на единицу ускорения центробежной силы и называется константой седиментации S. Так как w имеет размерность, обратную времени (радиан/сек), то 5 имеет размерность времени (сек). Значения 5 для белковых растворов, как правило, порядка 10^-13—10^-12 сек. Величину S, равную 10^-13 сек, принимают за единицу константы седиментации и обозначают как 1 ед. Сведберга, или 1 S. Подставляя величину S в уравнение (39), можно написать:

Это уравнение лежит в основе определения молекулярных весов макромолекул по методу скорости седиментации. Метод включает определение не только константы седиментации и коэффициента диффузии при данной температуре и в среде с известной вязкостью, но также и определение удельного парциального объема.

Для нахождения константы седиментации измеряют на седиментационной диаграмме положения границ седиментации через определенные промежутки времени центрифугирования и рассчитывают константу по нижеприведенной формуле:

где х_n и х_m - положения границы седиментации соответственно во время t_n и t_m. Величины x и t можно получить из опыта; остается только рассчитать угловую скорость w. Угловая скорость выражается в радианах в секунду. Известно, что радиан— это угол, дуга которого равна радиусу, и что один оборот равен радиан. Следовательно, помножив величину скорости вращения ротора (об/сек) на 2пс, мы получим значение w.

Величина константы седиментации зависит от плотности, вязкости и температуры растворителя. Поэтому для сравнения различных белков принято приводить эти константы к стандартным условиям (вода, 20°). В этом случае константа седиментации обозначается как S₂₀, w и рассчитывается по формуле

где η_t, и р_t — вязкость, парциальный удельный объем и плотность солевого раствора при температуре — те же величины для воды при 20. Значения этих величин могут быть получены из соответствующих таблиц.

Поскольку в растворах белков могут происходить процессы агрегации, степень которой зависит от концентрации белка, постольку желательно устранить влияние концентрации на скорость седиментации. Это достигается путем измерения константы седиментации при различных концентрациях белка и графической экстраполяцией приведенных величин S₂₀, w к нулевой концентрации. В результате получают величину константы седиментации, которую обозначают как