Химия белка - Часть 1 - Общая химия белка - Ашмарин И. П 1968

Денатурация белков
Денатурирующие воздействия

Денатурирующие воздействия принято разделять на химические, физические и биологические. Хотя эта классификация удобна, она несколько произвольна, поскольку процесс денатурации вызывается обычно несколькими взаимосвязанными факторами (например, температура и концентрация водородных ионов).

Химические агенты. Многие белки дендтурируются при крайних значениях концентрации водородных ионов — как правило, при pH, меньшем 2—3 или большем 10—11. Видимо, в этих условиях денатурация обусловлена тем, что практически все полярные группы заряжены одноименно (преимущественно H₃N-гpyппы при низких значениях pH и СОО^--группы — при высоких). Это ведет к взаимному электростатическому отталкиванию таких групп и нарушению уникального расположения полипептидных «цепей с разрывом части слабых связей, поддерживающих исходную структуру. Такой механизм действия крайних концентраций водородных ионов хорошо иллюстрируется опытами по «плавлению» а-спиральных структур синтетических полипептидов, состоящих либо из дикарбоновых аминокислот, либо из диаминомонокарбоновых кислот в области щелочных и кислых значений pH соответственно.

Следует отметить, что ряд белков довольно устойчив при крайних значениях pH. Так, при pH 2 довольно стабильны гистоны, протамины, трипсин, химотрипсин, рибонуклеаза, лизоцим и ряд других. Лизоцим, гистоны и протамины устойчивы и при pH 10. Наконец, известны белки, денатурирующиеся и внутри «зоны устойчивости». Например, миозин денатурируется уже при pH 6,0, гемоцианин и липопротеиды — при pH ~5, а пепсин — при pH 6.

Денатурация может быть вызвана при помощи ряда органических веществ и растворителей. К таким органическим веществам относятся прежде всего мочевина, соли гуанидина, уретан и аналогичные амиды. Их действие связано с наличием амидной группировки, благодаря чему они способны «конкурировать» с пептидными группировками белка в отношении образования водородных связей, переключая их на себя. Это приводит к распаду некоторых белков на отдельные субъединицы или к переходу полинептидных цепей из спирализованной формы в статистический клубок. Для максимального проявления действия амиды должны присутствовать в больших концентрациях — например, для мочевины она может достигать 8 М.

Следующая группа денатурирующих органических веществ — ионные детергенты (например, додецилсульфат натрия) и салицилат натрия - имеют, видимо, другой механизм действия. Оно обусловлено стехиометрическим соединением денатурирующих агентов с противоположно заряженными группами белка. Электростатическое отталкивание одноименно заряженных групп, оставшихся в цепи, приводит к разрыву водородных и иных связей, стабилизирующих нативное состояние.

Сложным механизмом денатурирующего действия, включающим как непосредственное воздействие на систему водородных связей, так и блокирование полярных группировок, обладают такие органические вещества, как трихлоруксусная кислота и так называемые алкалоидные осадители (пикриновая кислота, таинин и т. п.).

Интересно, что процесс денатурации белков, вызванный всеми перечисленными органическими веществами, не зависит от температуры и, для мочевины например, может иметь отрицательный температурный коэффициент. Этим они существенно отличаются от органических растворителей — таких, как, например, спирт или ацетон. Последние денатурируют и необратимо осаждают белок из растворов при комнатной и более высоких температурах. При критической температуре, лежащей около 65°, осаждение белка происходит при относительно невысоких концентрациях органических растворителей. Тем не менее, как уже указывалось в гл. I, при температурах, близких к точке замерзания, можно производить фракционирование белков добавлением различных количеств растворителей, не вызывая их денатурации. Полагают, что осаждающее и денатурирующее

действие органических растворителей связано с их влиянием на диэлектрическую постоянную раствора. Последняя значительно уменьшается, вследствие чего увеличиваются электростатические силы взаимодействия между заряженными группами как внутри молекулы, так и между различными молекулами. Образование прочных внутри- и межмолекулярных солеобразных связей и приводит к необратимой коагуляции белка.

Наконец, из химических агентов необходимо упомянуть такие денатурирующие вещества, как ионы тяжелых металлов, также ионы тиоцианата и йода. Эти вещества, по-видимому, образуют довольно прочные соединения с полярными группами белков, искажая систему ионных и водородных связей нативной белковой молекулы.

Физические агенты. Денатурация белков может осуществляться и за счет действия различных физических агентов. Наиболее общим и наиболее изученным денатурирующим воздействием является нагревание. Тепловое движение полипептидных цепей вызывает как разрыв водородных связей между ними, так и нарушение взаимодействия гидрофобных групп. При постепенном повышении температуры можно наблюдать иногда признаки ступенчатого, скачкообразного течения процесса денатурации. По-видимому, процесс разрушения водородных связей в нативных молекулах имеет кооперативный характер, что позволяет говорить о температуре и теплоте плавления а-спиральных участков у ряда белков. Денатурированные нагреванием белки легко агрегируют и выпадают в осадок, хотя коагуляция представляет собой вторичное явление. Вероятно, коагуляция является результатом возникновения дополнительных дисульфидных мостиков, солеобразных и вторичных водородных связей между различными молекулами. То, что коагуляция тесно связана с образованием дисульфидных связей, подтверждается тем фактом, что n-хлормеркурибензоат ингибирует свертывание. В свою очередь коллаген, не содержащий сульфгидрильных групп, при нагревании превращается в растворимую желатину.

Так как агрегация всегда сопровождает тепловую денатурацию, то количество осаждаемого белка может служить показателем скорости процесса. При этом скорость тепловой денатурации значительно зависит от pH среды: она минимальна при изоэлектрической точке и увеличивается при сдвиге pH в обе стороны от изоточки.

Следует отметить, что наряду с подавляющим большинством термолабильных белков известны белки, весьма устойчивые к нагреванию. К ним прежде всего относятся белки бактерий, живущих в водах горячих источников, а также рибонуклеаза, лизоцим, трипсин, химотрипсин и ряд других.

Белки денатурируют при таких механических воздействиях, как высокое давление (порядка 5000—10 000 атм), растирание сухих препаратов, а также энергичное встряхивание растворов и растекание с образованием поверхностной пленки. Денатурация при растекании объясняется тем, что на поверхности раздела возникает монослой белка, в котором полипентидные цепи развертываются. Чувствительность белка к этим воздействиям весьма различна: яичный альбумин, например, очень легко денатурируется при встряхивании раствора, тогда как активность инсулина не изменяется. Липопротеиды подвержены денатурации и диссоциации при замораживании. К механическим денатурирующим воздействиям следует также отнести и облучение звуковыми волнами высокой частоты. Это следует учитывать при использовании ультразвуковых генераторов для разрушения клеток с целью экстракции белков. При частоте порядка 10 кгц и тщательном охлаждении озвучиваемого раствора денатурация обычно незначительна или не наблюдается вовсе.

Белки денатурируют при облучении ультрафиолетовым светом, а также большими дозами рентгеновых и у-лучей. Действие ультрафиолетового света особенно выражено при длинах волн от 260 до 310 ммк, причем основное поглощение обусловлено кольцами тирозина и триптофана. Показано, что при длительном воздействии ультрафиолетовых лучей происходит разрыв пептидных связей, смежных с ароматическими кольцами. При действии ионизирующего излучения могут также возникать разрывы между а-углеродными атомами и боковыми цепями аминокислот. Кроме того, возможны вторичные процессы, вызванные образованием различных свободных радикалов типа О₂Н, Н₂О₂, ОН и т.д. Последние являются сильными окислителями, воздействующими на тиоловые группы и разрывающими дисульфидные связи.

Биологические агенты. Наконец, денатурация белков, по-видимому, происходит и при действии протеолитических ферментов. Известно, что последние хорошо расщепляют только денатурированные белки. Это позволяет допустить, что первый этап действия этих ферментов на белок состоит в денатурации его молекул или в таком изменении его структуры, которое открывает расщеплению наиболее важные пептидные группы. Признаком денатурации на первом этапе протеолиза служит увеличение отрицательного оптического вращения и уменьшение объема раствора, наблюдаемое в той же мере, как и при денатурации белка мочевиной.

В заключение краткого обзора агентов, вызывающих денатурацию белков, необходимо упомянуть о средствах предотвращения этого процесса. Некоторые из них уже рассматривались в начале гл. I в связи с проблемой очистки и хранения белковых препаратов. Поэтому мы ограничимся лишь напоминанием о стабилизирующем действии холода, высоких концентраций ряда нейтральных солей и самого белка, о значении pH раствора и, наконец, о стабилизации белковых препаратов посредством высушивания под вакуумом из замороженного состояния (лиофилизации). Кроме того, известен ряд других факторов, предохраняющих белки от денатурации. Так, тепловая денатурация ряда белков тормозится концентрированными растворами сахаров (глюкозы, фруктозы, сахарозы и др.) и многоатомных спиртов. Эффективным средством защиты от денатурирующего действия мочевины, солянокислого гуанидина и нагревания являются малые концентрации длинноцепочечных органических ионов, анионов жирных кислот (каприлат натрия) и детергентов (додецилсульфат натрия). Интересно, что опять-таки малые концентрации, таких денатурирующих агентов, как мочевина, могут защищать от тепловой денатурации некоторые белки (например, сывороточный альбумин). Действие этих агентов обусловлено, вероятно, связыванием их белковыми частицами с образованием гидрофильных комплексов. В таких комплексах белок покрыт оболочкой из адсорбированных молекул, мешающей образованию агрегатов с другими белковыми частицами.