Биохимия и молекулярная биология - Белясова Н.А. 2002

Молекулярные основы и механизмы наследственности
Сохранение постоянства и изменчивость геномов
Явление рестрикции-модификации ДНК

Сохранение постоянства наследственной информации, с одной стороны, и изменчивость геномов — с другой, представляют собой две противодействующие силы, между которыми происходит постоянное соперничество. Сама организация ДНК, являющихся молекулами, в которых зашифрована генетическая информация всех клеточных организмов, способствует надежному хранению этой информации, поскольку содержит две комплементарные цепочки. В случае каких-либо нарушений в одной из них вторая может служить матрицей для исправления этих искажений, что действительно имеет место в многочисленных репарационных процессах. Кроме того, двойная спираль обусловливает возможность воспроизведения себе подобных молекул, и процессы репликации ДНК осуществляются с высокой точностью (глава 1). Наконец, многие (если не все) клетки имеют систему защиты от проникновения в них чужеродной ДНК — это, в первую очередь, набор нуклеаз — ферментов, способных деградировать нуклеиновые кислоты. Среди таких нуклеаз особое значение имеют рестрикционные ферменты (рестриктазы).

Однако эволюция была бы не возможной, если бы отсутствовали процессы генетической изменчивости: несмотря на все усилия организмов сохранить неизменным свой геном, он все же поддается изменениям. Основной вклад в процесс изменчивости геномов вносят следующие процессы: мутагенез, генетический обмен и рекомбинационные события, а также деятельность мобильных генетических элементов.

Перечисленные процессы, направленные на сохранение постоянства и изменение наследственной информации, рассмотрены в данной теме.

В систему рестрикции—модификации входят ферменты, относящиеся к двум классам: одни из них модифицируют молекулы ДНК, находящиеся в клетке, а другие расщепляют чужеродные молекулы ДНК (или свои, не модифицированные) в этих же сайтах.

Впервые явление рестрикции—модификации обнаружено С. Лурия в 50-х гг. прошлого столетия в экспериментах по инфицированию бактерий E coli бактериофагом λ. Оказалось, что бактериофаги, размноженные на бактериях одного штамма кишечной палочки, инфицировали клетки некоторых других штаммов с низкой эффективностью. Наблюдалось и обратное явление: полученные в ходе этого низкопродуктивного литического цикла фаги инфицировали клетки исходного штамма также плохо. Было высказано предположение,

которое впоследствии подтвердилось, что фаговая ДНК подвергается в бактериях E. coli модификации, которая защищает ее от хозяйских ферментов рестрикции, но не от подобных ферментов в других штаммах.

В настоящее время известно, что модификацией, защищающей геном клетки и некоторые инфицирующие фаговые ДНК, является штамм-специфичное метилирование определенных азотистых оснований в ДНК. Причем ферментативное присоединение заместителей к азотистым основаниям происходит уже после включения соответствующих нуклеотидов в цепи ДНК, начиная с этапа образования фрагментов Оказаки. Метилируются нуклеотиды, занимающие строго определенное положение в молекуле, а ферменты, осуществляющие эти реакции, относятся к единой системе рестрикции—модификации. Ферменты рестрикции, входящие в такую систему, узнают в ДНК те же последовательности нуклеотидов и осуществляют специфическое расщепление ДНК в этих (либо прилегающих) последовательностях, если они не модифицированы.

Структура сайтов рестрикции—модификации расшифрована для более чем 200 рестрикционных ферментов.

Различают три типа эндонуклеаз рестрикции (I, II, III). Ферменты I и III типов обладают как нуклеазной, так и метилирующей активностями. При этом эндонуклеазы I типа узнают в ДНК определенную последовательность и разрезают двухцепочечную ДНК на разном (не фиксированном) расстоянии от сайтов узнавания. Эндонуклеазы типа III осуществляют двухцепочечные разрезы ДНК на расстоянии ~25 п. н. от своих сайтов узнавания. Только эндонуклеазы типа II производят двухцепочечные разрезы ДНК по специфическим фосфодиэфирным связям либо в пределах самого сайта узнавания, либо на небольшом, но вполне определенном удалении от него. Ферменты этого типа не обладают метилирующей активностью. Некоторые из эндонуклеаз II типа узнают специфические группы из четырех нуклеотидов, другие — гексануклеотидные последовательности, причем их общей особенностью является палиндромная структура (рис. 2.1). В этом случае одна и та же последовательность располагается в двух цепях в противоположных направлениях симметрично, относительно оси симметрии в середине палиндрома.

Рис. 2.1. Расщепление ДНК с помощью рестриктазы Eco Rl из Escherichia coli RY13. Слева показана структура сайта рестрикции фермента Eco Rl: пунктиром изображена ось симметрии палиндрома; вертикальными стрелками — ковалентные связи между нуклеотидами, которые подвергаются расщеплению. Справа показаны фрагменты ДНК, образованные в результате рестрикции

Как показано на рис. 2.1, результатом действия многих рестриктаз на молекулы ДНК, является разрезание их «уступом» в немодифицированных сайтах. При таком способе расщепления двухцепочечных ДНК образуются фрагменты, у которых имеется концевая избыточность, или так называемые «липкие» концы. В составе «липких» концов, образованных под действием одной рестриктазы, последовательности нуклеотидов комплементарны (рис. 2.1). Указанные особенности функционирования рестриктаз II типа делают их незаменимыми инструментами в генетической инженерии: это молекулярные ножницы, с помощью которых in vitro осуществляется фрагментирование ДНК.

В настоящее время рестрикционные ферменты выделены из более чем 400 штаммов бактерий, и для большей их части определена структура сайтов рестрикции. Система рестрикции—модификации может рассматриваться как своеобразный барьер, охраняющий клетку от включения в нее чужеродного генетического материала. Возникновение мутантов, лишенных способности к рестрикции, открывает дополнительные возможности для изменчивости у этих штаммов.

Недавно обнаружена способность некоторых конъюгативных плазмид и фагов преодолевать барьеры рестрикции клеток-хозяев, куда они попадают при конъюгации или инфекционном процессе. Это явление получило название антирестрикция. В геномах плазмид и фагов обнаружены гены ard, детерминирующие структуру белков-антирестриктаз. Эти белки ингибируют ферменты, принадлежащие к системе рестрикции—модификации типа I.