Биохимия и молекулярная биология - Белясова Н.А. 2002
Основы генетической инженерии
Создание и анализ клонотек геномов
Генетическая инженерия как основа современной биотехнологии зародилась в семидесятые годы ХХ ст. в недрах молекулярной биологии. К этому времени были расшифрованы механизмы основных матричных процессов, происходящие в клетках прокариот — репликация, транскрипция и трансляция, кроме того, эти процессы были воспроизведены in vitro. Была определена структура генетического кода и синтезирован первый ген (аланиновой тРНК дрожжей). Удалось выделить и изучить свойства некоторых ферментов, использующих в качестве субстрата ДНК (рестриктазы, лигазы, ДНК-полимеразы). Эмбриологи освоили методологию пересадки ядер соматических клеток животных (лягушки) взамен удаленного гаплоидного ядра, что позволило воспроизводить животных неполовым путем, т. е. клонировать (получать генетически идентичные особи).
Так, впервые появилась надежда на возможность замены определенных генов (например, дефектных) в зародышевых клетках на другие — полноценные, иными словами, осуществления генной терапии. Однако для этого необходимо было освоить методологию выделения генов, их идентификации, тиражирования, устойчивого культивирования в составе автономно реплицирующихся молекул, а также определения свойств продуктов этих генов. Все эти вопросы решает генетическая инженерия, под которой подразумевают комплекс молекулярно-генетических методов, позволяющих осуществить целенаправленное конструирование организмов путем манипуляций с их наследственным аппаратом.
Поскольку микроорганизмы, в частности бактерии, как одни из наиболее просто организованных форм живого, изучены гораздо лучше с генетической точки зрения, чем макроорганизмы, первые эксперименты по получению рекомбинантных ДНК были осуществлены именно с бактериальными клетками. И вскоре обнаружилась еще одна важная перспектива использования достижений генетической инженерии, а именно конструирование высокопродуктивных штаммов микроорганизмов—продуцентов биологически активных веществ, обладающих комплексом заданных свойств.
В данной главе охарактеризованы основные методы, позволяющие получать определенные гены, вводить их в состав векторных молекул для клонирования в клетках-реципиентах, идентифицировать гены в клонотеках, определять последовательность нуклеотидов в ДНК. Знание данной методологии необходимо для современных биотехнологов, использующих для создания организмов — продуцентов нужных веществ достижения генетической инженерии.
Для конструирования организмов с заданными свойствами требуется иметь набор генов, детерминирующих желаемые функции (утилизация определенных субстратов, биосинтез и секреция определенных продуктов, устойчивость к определенным физическим и химическим факторам, деградация ксенобиотиков и т. п.). Такие гены можно выделить из любых организмов, обладающих соответствующими свойствами, но для этого вначале следует получить клонотеку генома данного организма и охарактеризовать ее. Под клонотекой генома понимают набор клонов бактерий или бактериофагов, каждый из которых содержит один тип рекомбинантной ДНК, а в совокупности — весь геном изучаемого организма, фрагменты которого распределены по отдельным клонам.