БИОХИМИЯ УЧЕБНИК ДЛЯ ВУЗОВ - Е. С. Северина - 2004

РАЗДЕЛ 2. ЭНЗИМОЛОГИЯ

VI. Ингибирование ферментативной активности

Под термином «ингибирование ферментативной активности» понимают снижение каталитической активности в присутствии определённых веществ — ингибиторов. К ингибиторам следует относить вещества, вызывающие снижение активности фермента. Следует отметить, что все денатурирующие агенты также вызывают уменьшение скорости любой ферментативной реакции, вследствие неспецифической денатурации белковой молекулы, поэтому денатурирующие агенты к ингибиторам не относят.

Ингибиторы вызывают большой интерес для выяснения механизмов ферментативного катализа, помогают установить роль отдельных ферментов в метаболических путях организма. В основе действия многих лекарственных препаратов и ядов лежит ингибирование активности ферментов, поэтому знание механизмов этого процесса крайне важно для молекулярной фармакологии и токсикологии.

Ингибиторы способны взаимодействовать с ферментами с разной степенью прочности. На основании этого различают обратимое и необратимое ингибирование. По механизму действия ингибиторы подразделяют на конкурентные и неконкурентные.

А. Обратимое ингибирование

Обратимые ингибиторы связываются с ферментом слабыми нековалентными связями и при определённых условиях легко отделяются от фермента. Обратимые ингибиторы бывают конкурентными и неконкурентными.

1. Конкурентное ингибирование

К конкурентному ингибированию относят обратимое снижение скорости ферментативной реакции, вызванное ингибитором, связывающимся с активным центром фермента и препятствующим образованию фермент-субстратного комплекса. Такой тип ингибирования наблюдают, когда ингибитор — структурный аналог субстрата, в результате возникает конкуренция молекул субстрата и ингибитора за место в активном центре фермента. В этом случае с ферментом взаимодействует либо субстрат, либо ингибитор, образуя комплексы фермент-субстрат (ЕS) или фермент-ингибитор (ЕI). При формировании комплекса фермента и ингибитора (ЕI) продукт реакции не образуется (рис. 2-21).

Рис. 2-21. Схема конкурентного ингибирования активности фермента.

Для конкурентного типа ингибирования справедливы следующие уравнения:

Е + S <=> ЕS —> Е + Р,

Е + I <=> ЕI.

Классический пример конкурентного ингибирования — ингибирование сукцинатдегидрогеназной реакции малоновой кислотой (рис. 2-22). Малоновая кислота — структурный аналог сукцината (наличие двух карбоксильных групп) и может так же взаимодействовать с активным центром сукцинат дегидрогеназы. Однако отщепление двух атомов водорода от малоновой кислоты невозможно; следовательно, скорость реакции снижается.

Рис. 2-22. Пример конкурентного ингибирования сукцинат- дегидрогеназы малоновой кислотой. I - сукцинат связывается с активным центром фермента сукцинатдегидрогеназы; II - в ходе ферментативной реакции происходит отщепление двух атомов водорода от сукцината и присоединение их к коферменту FAD. В результате образуется фумарат, который высвобождается из активного центра сукцинатдегидрогеназы; III - малоновая кислота — структурный аналог сукцината, она также связывается с активным центром сукцинатдегидрогеназы. При этом химическая реакция не идёт.

Кинетические зависимости

Конкурентные ингибиторы уменьшают скорость химической реакции. Конкурентный ингибитор повышает Кm для данного субстрата (уменьшает сродство субстрата к ферменту). Это означает, что в присутствии конкурентного ингибитора необходима большая концентрация субстрата для достижения 1/2 V_max.

Увеличение соотношения концентрации субстрата и ингибитора снижает степень ингибирования. При значительно более высоких концентрациях субстрата ингибирование полностью исчезает, потому что активные центры всех молекул фермента будут находиться преимущественно в комплексе с субстратом.

Лекарственные препараты как конкурентные ингибиторы

Многие лекарственные препараты оказывают своё терапевтическое действие по механизму конкурентного ингибирования. Например, четвертичные аммониевые основания ингибируют ацетилхолинэстеразу, катализирующую реакцию гидролиза ацетилхолина на холин и уксусную кислоту (см. схему ниже).

При добавлении ингибиторов активность ацетилхолинэстеразы уменьшается, концентрация ацетилхолина (субстрата) увеличивается, что сопровождается усилением проведения нервного импульса. Ингибиторы холинэстеразы используют при лечении мышечных дистрофий. Эффективные антихолинэстеразные препараты — прозерин, эндрофоний и др. (рис. 2-23).

Рис. 2-23. Схема активного центра ацетилхолинэстеразы. А - присоединение ацетилхолина в активном центре фермента. Стрелкой указано место гидролиза эфирной связи в молекуле ацетилхолина; Б - присоединение конкурентного ингибитора — прозерина в активном центре фермента. Указано место гидролиза прозерина, однако реакция идёт намного медленнее, чем с ацетилхолином; В - присоединение конкурентного ингибитора в активном центре фермента — эндрофония. Эндрофоний связывается в активном центре ацетилхолинэстеразы, препятствуя присоединению ацетилхолина.

Антиметаболиты как лекарственные препараты

В качестве ингибиторов ферментов по конкурентному механизму в медицинской практике используют вещества, называемые антиметаболитами. Эти соединения, будучи структурными аналогами природных субстратов, вызывают конкурентное ингибирование ферментов, с одной стороны, и, с другой — могут использоваться этими же ферментами в качестве псевдосубстратов, что приводит к синтезу аномальных продуктов. Аномальные продукты не обладают функциональной активностью; в результате наблюдают снижение скорости определённых метаболических путей.

В качестве лекарственных препаратов используют следующие антиметаболиты: сульфаниламидные препараты (аналоги парааминобензойной кислоты), применяемые для лечения инфекционных заболеваний (см. раздел 9), аналоги нуклеотидов для лечения онкологических заболеваний (см. раздел 10).

2. Неконкурентное ингибирование

Неконкурентным называют такое ингибирование ферментативной реакции, при котором ингибитор взаимодействует с ферментом в участке, отличном от активного центра (рис. 2-24). Неконкурентные ингибиторы не являются структурными аналогами субстрата.

Неконкурентный ингибитор может связываться либо с ферментом, либо с фермент-субстратным комплексом, образуя неактивный комплекс. Присоединение неконкурентного ингибитора вызывает изменение конформации молекулы фермента таким образом, что нарушается взаимодействие субстрата с активным центром фермента, что приводит к снижению скорости ферментативной реакции.

Рис. 2-24. Схема неконкурентного ингибирования активности фермента.

Кинетические зависимости

Кинетическая зависимость неконкурентного ингибирования представлена на рис. 2-25. Этот тип ингибирования характеризуется снижением Vm_ах ферментативной реакции и уменьшением сродства субстрата к ферменту, т. е. увеличением К_m.

Рис. 2-25. Влияние неконкурентного ингибитора на скорость ферментативной реакции в зависимости от концентрации субстрата. V_mах — максимальная скорость реакции в отсутствие ингибитора; '\/_mах — максимальная скорость реакции в присутствии ингибитора; К_m — константа Михаэлиса в отсутствие ингибитора; 'К_m — константа Михаэлиса в присутствии ингибитора.

Б. Необратимое ингибирование

Необратимое ингибирование наблюдают в случае образования ковалентных стабильных связей между молекулой ингибитора и фермента. Чаще всего модификации подвергается активный центр фермента. В результате фермент не может выполнять каталитическую функцию.

К необратимым ингибиторам относят ионы тяжёлых металлов, например, ртути (Нg²⁺), серебра (Аg⁺) и мышьяка (Аs³⁺), которые в малых концентрациях блокируют сульфгидрильные группы активного центра. Субстрат при этом не может подвергаться химическому превращению (рис. 2-26). При наличии реактиваторов ферментативная функция восстанавливается. В больших концентрациях ионы тяжёлых металлов вызывают денатурацию белковой молекулы фермента, т. е. приводят к полной инактивации фермента.

Рис. 2-26. Механизм действия ионов ртути как необратимого ингибитора. Ионы ртути в малых концентрациях блокируют сульфгидрильные группы активного центра, что приводит к снижению скорости ферментативной реакции.

1. Специфические и неспецифические ингибиторы

Использование необратимых ингибиторов представляет большой интерес для выяснения механизма действия ферментов. С этой целью применяют вещества, блокирующие определённые группы активного центра ферментов. Такие ингибиторы называют специфическими. Ряд соединений легко вступает в реакции с определенными химическими группами. Если эти группы участвуют в катализе, то происходит полная инактивация фермента.

Роль гидроксильных групп серина в механизме катализа исследуют с помощью фторфосфатов, например, диизопропилфторфосфата. Диизопропилфторфосфат (ДФФ) специфически реагирует лишь с одним из многих остатков серина в активном центре фермента. Остаток Сер, способный реагировать с ДФФ, имеет идентичное или очень сходное аминокислотное окружение (табл. 2-2). Высокая реакционная способность этого остатка по сравнению с другими остатками Сер обусловлена аминокислотными остатками, также входящими в активный центр ферментов.

Таблица 2-2. Исследование последовательности аминокислотных остатков вокруг реакционноспособного остатка серина, взаимодействующего с ДФФ

ДФФ относят к специфическим необратимым ингибиторам «сериновых» ферментов, так как он образует ковалентную связь с гидроксильной группой серина, находящегося в активном центре и играющего ключевую роль в процессе катализа (рис. 2-27).

Рис. 2-27. Ингибирование активности химотрипсина с помощью диизопропилфторфосфата.

Ацетат йода, п-хлормеркурибензоат легко вступают в реакции с SН-группами остатков цистеина белков (рис. 2-28). Эти ингибиторы не относят к специфичным, так как они реагируют с любыми свободными SН-груп- пами белков и называются неспецифическими ингибиторами. Если SН-группы принимают участие непосредственно в катализе, то с помощью этих ингибиторов представляется возможным выявление роли SН-групп фермента в катализе.

Рис. 2-28. Ингибирование активности ферментов вследствие ковалентной модификации остатков цистеина.

2. Необратимые ингибиторы ферментов как лекарственные препараты

Пример лекарственного препарата, действие которого основано на необратимом ингибировании ферментов, — широко используемый препарат аспирин. Противовоспалительный нестероидный препарат аспирин обеспечивает фармакологическое действие за счёт ингибирования фермента циклооксигеназы, катализирующего реакцию образования простагландинов из арахидоновой кислоты. В результате химической реакции ацетильный остаток аспирина присоединяется к свободной концевой NH₂-группе одной из субъединиц циклооксигеназы (см. схему ниже).

Это вызывает снижение образования продуктов реакции простагландинов (см. раздел 8), которые обладают широким спектром биологических функций, в том числе являются медиаторами воспаления.