Общая биотехнология: Курс лекций Часть II - Блинов В.А. 2004

Производство белка одноклеточных. Многотоннажное микробиологическое производство ферментных препаратов

♦ Нетрадиционные источники белка.

♦ Сырьевая база для синтеза белка одноклеточных.

♦ Технологическая схема получения кормовой биомассы.

♦ Перспективы использования биомассы.

♦ Производство ферментных препаратов различного назначения.

Пища представляет собой комплекс смешанных продуктов, которые различаются по химическому составу, питательным свойствам и биологическому действию. Одни продукты питания служат источниками пластических и ростовых веществ, другие - источниками энергии, третьи - обеспечивают поступление в организм необходимых, жизненно важных, биологически активных компонентов.

Основными источниками пластических соединений являются продукты питания животного происхождения. Их важнейшая составная часть - белок содержит незаменимые аминокислоты, благоприятно сбалансированные для синтеза собственных белковых соединений организма.

В питании человека мясо и мясные продукты являются не только основным источником полноценного белка, но и жира, комплекса витаминов и минеральных веществ. Усвояемость белка составляет не менее 96 %. Важную роль играют и белки растительных пищевых продуктов, хотя их усвояемость ниже и находится в пределах 70-85 %. Однако рациональное соотношение животных и растительных пищевых продуктов обеспечивает оптимальное белковое питание за счет взаимного дополнения их аминокислотного состава.

Энергетическими источниками в питании человека служат в основном продукты, богатые углеводами и жирами. Наконец, все нишевые продукты в той или иной степени являются источниками биологически активных, регуляторных веществ.

В питании важно не только обеспечение организма энергетическим и пластическим материалом. Необходимо, чтобы пища регулировала физиологические функции, биохимические и поведенческие реакции, снижала риск возникновения заболеваний, ускоряла процесс выздоровления после различных болезней, способствовала долголетию. С этой целью в пищевой рацион сегодня включают бифидобактерии, бифидогенные факторы различного происхождения, растительные волокна, аминокислоты, пептиды, витамины, жирные кислоты, холин, гликозиды, определенные минералы и др. Ассортимент подобных биологически активных веществ неуклонно расширяется.

При пищевом дефиците белка в организме животных и человека развиваются глубокие негативные изменения. Они проявляются в виде отрицательного азотистого баланса, гипопротеинемии, нарушении коллоидно-осмотического и водносолевого обмена Последствиями длительного недостатка белка являются анемии различной формы, нарушения в функциях нервной, эндокринной и сердечно-сосудистой систем, глубокие сдвиги в обмене веществ, остановка роста, истощение и т.д. Особенно тяжелые нарушения развиваются в молодом возрасте. Подчеркнем, что весьма опасны не только случаи полного отсутствия белка в пище, по и недостаточное поступление его в организм или поступление некачественного белка. Белок пищи должен содержать все аминокислоты, особенно незаменимые, быть по составу близок аминокислотному составу белков организма и легко перевариваться в желудочно- кишечном тракте.

Нетрадиционные источники белка. В настоящее время мировой дефицит пищевого белка составляет более 15 млн т в год. Эта величина незаменимого компонента пищи трудно восполнима, ибо связана с сокращением пахотных земель, истощением, засолением и эрозией почв, урбанизацией, потерями урожая из-за вредителей, болезней сельскохозяйственных культур, загрязнения биосферы, с уменьшением поголовья сельскохозяйственных животных, снижением их продуктивности, вследствии недостаточной кормовой базой и пр. Недостаток кормового белка в масштабах планеты, по данным ФАО ООН, оценивается примерно в 30 млн т в год.

Коренным образом изменить эту ситуацию возможно лишь биотехнологическим путем. Причем продуцентами пищевого, и особенно кормового белка, могут быть бактерии, дрожжи, микроскопические водоросли, микро- и макромицеты. Микробная биомасса имеет очень высокую скорость роста, в ней содержится до 70-80 % белка, в составе которого много незаменимых аминокислот и других, важных биологически активных веществ.

Сырьевые источники для синтеза микробного белка весьма значительны и легко доступны. Это парафины нефти, различные спирты, в том числе метанол и этанол, природный газ, всевозможные отходы промышленности, особенно мясной и молочной, сельского хозяйства. Доступным и дешевым источником питания для бактерий является растительная биомасса.

С технологической точки зрения наилучшими из них являются дрожжи. Их легко выращивать в производственных условиях. Дрожжи быстро растут и размножаются практически на любых субстратах, устойчивы к контаминантной микрофлоре, содержат белка больше, чем зерно злаковых культур, лишь несколько уступая по аминокислотному составу протеину молока и рыбной муки. Дрожжи весьма богаты многими витаминами. Это: тиамин, рибофлавин, пантотеновая и никотиновая кислоты, пиридоксин, фолиевая кислота, а также холин, инозит и др. Дрожжевые клетки содержат микроэлементы и значительное количество жира, в котором преобладают ненасыщенные жирные кислоты. Один кг кормовых дрожжей содержит 1,03-1,16 кормовых единиц. К недостаткам дрожжей относят толстую клеточную стенку и большое количество нуклеиновых кислот.

Продуцентами белка являются также бактерии. Для них характерна высокая скорость роста. Содержание белка в биомассе составляет 70-80 %. При значительном количестве метионина бактерии легко поддаются селекции, что позволяет получать высокопродуктивные штаммы. Их недостатками являются: трудная осаждаемость вследствие малых размеров клеток, значительная чувствительность к инфекциям, особенно фаговым, и высокое содержание в биомассе нуклеиновых кислот.

В последнее время существенно возрос интерес к водорослям, как источникам белка. Микроскопические водоросли как фототрофы для образования своей биомассы используют только углекислый газ атмосферы. Известно, что с 0,1 га поверхности прудов можно получить столько же белка, сколько с 14 га посевов фасоли. Некоторые народы с давних времен употребляют в пишу морские и океанические водоросли. Например, в Японии известно свыше 300 рецептур, в состав которых входят водоросли.

Выращивание водорослей в виде аквакультур - процветающая отрасль биотехнологии. Сейчас особое внимание уделяется сине-зеленой водоросли - спирулине (Spirulina platensis и Spirulina maxima). Ее биомасса соответствует лучшим стандартам пищевого белка, в ней достаточно витаминов A, D, а также группы В. Белок водорослей пригоден как для кормовых, так и пищевых целей.

Другой пример, в Сибири произрастает более 300 видов съедобных растений, не считая грибов и водорослей. Из них дополнительным источником пищевого белка могут быть водяной орех, горец змеиный, колосник, крапива, лох, манник, лопух, стрелолист, щавель и др. Причем многие виды этих растений превосходят по питательным и вкусовым качествам культурные растения или вообще не имеют аналогов.

Наконец, важным источником высококачественного белка могут быть грибы, как низшие, так и высшие. Высокая питательная ценность плодовых тел высших грибов известна давно. Однако их валовой сбор в природных условиях, естественно, не может удовлетворить все возрастающие потребности в белке. Поэтому были сделаны попытки культивирования в промышленных условиях мицелия макромицетов. При этом исходили из предположения, что грибница будет по вкусовым и питательным качествам соответствовать плодовым телам грибов. Это оказалось не так. Вегетативное тело высших грибов (мицелий) было лишено вкуса, аромата, пищевой ценности плодовых тел, а среда для выращивания грибницы оказалась очень сложной и дорогостоящей. В то же время мицелий микромицетов используется давно и пользуется заслуженной популярностью. Так, в Индонезии арахисовые лепешки обращивают плесневыми грибами рода Rhisopus. В Японии на соевых бобах культивируют плесневый гриб Aspergillus orysae. В Китае своеобразный деликатес получают при выращивании на соевых бобах грибов рода Mucor. Таких примеров немало. Важно, что благодаря микромицетам крахмалсодержащая пища обогащается белком и становится подобной мясным продуктам. Вероятно, микромицеты в недалеком будущем явятся одним из перспективных, нетрадиционных источников пищевого белка.

Правда по сравнению с эталонным белком, белки грибов лимитированы по сумме аминокислот, содержащих серу (цистеин и метионин). Вместе с тем они богаты лизином - основной аминокислотой, недостающей в белке зерновых культур. Это позволяет на основе зерна и грибной биомассы составлять сбалансированные пищевые и кормовые смеси.

Сырьевая база для синтеза белка одноклеточных. Для получения микробного белка необходим богатый углеродом, но дешевый субстрат. Этому требованию отвечают нормальные (неразветвленные) парафины нефти (н-парафины). Высокий выход биомассы (до 100 % от массы субстрата) обеспечивается большим содержанием углерода, а качество продукта - степенью чистоты парафинов. Если парафины очищены недостаточно, то дрожжевая биомасса содержит неметаболизируемые компоненты: производные бензола, D-аминокислоты, липиды с нечетным числом углеродных атомов в жирных кислотах, токсины белковой природы. Поэтому парафины нефти должны быть тщательно очищены. Дрожжи, выращенные на н-парафинах, используются в количестве 8-15 % от общего белка рациона для откорма крупного рогатого скота, свиней, овец и бройлеров.

Другим перспективным источником углерода для культивирования продуцентов белка является метанол. Его получают методом микробного синтеза из древесины, соломы, городских отходов. Сложность использования метанола заключается в том, что молекула его содержит только один атом углерода, тогда как синтез большинства органических соединений осуществляется через двухуглеродные молекулы. Соединения же с нечетным числом атомов углерода, как правило, небезразличны для организма. В качестве продуцента используются бактерии рода Methylomonas. Метанол усваивают бактерии, дрожжи, грибы, актиномицеты. Получение белка на метаноле более экономично, чем при использовании н-парафинов. Например, продукт «Прутин» (Великобритания) содержит 72 % сырого протеина, используется как высокобелковая добавка к комбикормам в рационах свиней, птицы, пушных зверей и в качестве заменителя молока для телят. Наряду с метанолом, источниками энергии для ряда микроорганизмов служат метан / и моноксид углерода.

Использование этанола как субстрата для микробного синтеза белка снимает проблему очистки биомассы от аномальных продуктов обмена с нечетным числом углеродных атомов. Стоимость производства этанола несколько выше, чем метанола. Такую технологию применяют в Чехии, Испании, Германии, Японии, США. В этих и других странах разработаны технологические процессы получения белка на природном газе с использованием бактерий Methylomonas, усваивающих метан, Hypomicrobium и Pseudomonas, утилизирующих метанол и др.

Особое внимание исследователей привлекает растительная биомасса, которая содержит большое количество сахаров. Это целлюлоза, состоящая из остатков молекулы глюкозы, гемицеллюлозы, состоящие из остатков арабинозы, галактозы, маннозы, фруктозы, ксилозы. На жидкой, содержащей сахара фракции гидролизата выращивают дрожжи. Кроме растительных гидролизатов для получения кормовых дрожжей используется послеспиртовая барда, подсолнечная лузга, хлопковая шелуха, отходы производства лубяных волокон (костер льна и конопли), свекловичный жом, отходы картофелекрахмального производства, пивоваренной, плодовоовощной, консервной промышленности и др. В качестве сырья для гидролизной промышленности используется солома злаковых культур, которая обычно прогеинизируется, например, дрожжеванием, или усвояемость соломы повышается вследствие действия ферментных препаратов (пектофоетидина ГЗх в комплексе с целловиридином ГЗх или глюкаваморином Пх). Широко используются способы прямой биоконверсии продуктов фотосинтеза и их производных в белок одноклеточных организмов с помощью высших и низших грибов. С этой целью используются целлюлозоразрушающие грибы Chaetomium cellulolytiсum, а также Aspergillus niger, Trichoderma и др.

Значительные перспективы открывает получение микробного белка из молочной сыворотки. Ежегодно в мире образуется около 200 млн т молочной сыворотки. Каждая тонна сыворотки содержит 50 кг молочного сахара, до 10 кг высокоценного белка, 1,5 кг жира, а также витамины, микроэлементы и др. Использование сыворотки малоэффективно как для производства кормов, так и для скармливания животных. Это связано с тем, что степень утилизации молочной сыворотки снижается по мере увеличения ее доли в рационе. Кроме того, при этом возникают расстройства пищеварения, а конверсия белка сыворотки в белок тела животного весьма незначительна. Это касается и сухой сыворотки, так как организм животного усваивает только 20 % ее количества из-за неблагоприятного соотношения углеводов, белков и минеральных солей.

В этом отношении более рациональным является производство молочно-белковых концентратов. При этом на основе белков сыворотки изготавливают заменители сухого обезжиренного молока, пищевые добавки и компоненты детского питания. Белки вводят в состав молочного шоколада, конфет, яичных и макаронных изделий, применяют в мясной, хлебопекарной, кондитерской промышленности. Молочный сахар применяется в медицинской и пищевой промышленности, при изготовлении различных напитков и т.д. Однако объем промышленной переработки сыворотки пока не превышает 50-60 % произведенного количества.

Лактоза может быть источником энергии для многих видов микроорганизмов, сырьем для микробного производства органических кислот, ферментов, спиртов, витаминов и, конечно, белковой биомассы. Для получения такой биомассы чаще всего используют дрожжи. Установлено, что коэффициент конверсии белка сыворотки в микробный белок у дрожжей в 20 раз выше, чем степень преобразования его в животный белок. Кроме того, большинство видов дрожжей обогащает сыворотку витаминами. В качестве продуцентов применяют различные штаммы родов Saccharomyces, Khiyveromyces fragilis, Candida, Trichosporon, Torulopsis.

Использование микроорганизмов в пищу связано с решением ряда вопросов, технологических - изыскание штаммов-продуцентов, подбор сырья и подходящих условий культивирования и медико-биологических безвредность получаемых продуктов. Для пищевых целей следует применять высокоочищенные изоляты микробных белков, но не цельноклеточную или частично облагороженную биомассу. Белковым изолятам надо придать вкус, цвет, запах и консистенцию привычной пищи. Наиболее сложен вопрос текстуры пищи. Это инженерная задача. Уже сейчас в ряде стран производятся текстураты микробных и растительных белков. Из белков сои, например, производят ветчину, бекон, сосиски и др.

Итак, человечество уже приступило к перестройке структуры производства продовольствия, переходу к использованию неограниченных возобновляемых ресурсов, их трансформации в пищу, корма, продукты технического назначения.

Технологическая схема получения кормовой биомассы. Подчеркнем еще раз преимущества производства биомассы с помощью микробного синтеза перед другими источниками белка. Во-первых, здесь высокая скорость накопления биомассы, которая в 500-5000 раз выше, чем у растений или животных. Во-вторых, микробные клетки накапливают большое количество белка (дрожжи - до 60 %, бактерии - до 75 % по массе). В-третьих, в производстве микробного белка отсутствует многостадийность: процесс биосинтеза протекает в мягких условиях при температуре 30-45 °С, pH - 3 -6 и давлении - 0,1 МПа. Он менее трудоемок по сравнению с получением сельскохозяйственной продукции и органическим синтезом белков.

Получение микробного белка - самая крупнотоннажная отрасль биотехнологии. Принципиальная технологическая схема выращивания кормовой биомассы следующая:

♦ отделение чистой культуры. Штаммы-продуценты из пробирок переносят в конические качалочные колбы со стерильной питательной средой. Колбы помещают на качалку и проводят культивирование в оптимальных по температуре и pH условиях, контролируют развитие микроорганизмов;

♦ чистую культуру в log-стадии переносят в малый посевной аппарат (500 л) с питательной средой, pH которой доводится аммиачной водой или известковым молоком до 5,5-5,8. Сначала в аппарат подают около 40 л среды, разбавляют ее в 4-4,5 раза стерильной водой и при интенсивной аэрации добавляют остальное количество питательной среды (80-100 л), pH среды 4,5-5,5. Из качалочных колб вносят микробную суспензию объемом 1,5-2 л (примерно 0,4 %) и производят культивирование до накопления в среде 3,5-4,0 г клеток/л по абсолютно сухому веществу (АСВ). Обычно для этого требуется 15-18 ч;

♦ суспензия из малого посевного аппарата подается в аппарат объемом 4-5 м³, предварительно заполненный питательной средой (-200 л) и стерильной водой (1,2-1,5 м³). Включается аэрация, и при постоянном доливе 70-75 л/ч питательной среды и добавлении аммиачной воды для поддержания заданного pH проводится культивирование 10-12 ч;

♦ затем выращивание засевной культуры проводится в ферментаторе 15-20 м³. Аппарат на 10 % (по объему) заполняется стерильной или кипяченой водой, туда же вводится около 0,5 м³ питательной среды и полностью перекачивается все содержимое предыдущего аппарата (2,5-2,7 м³). Выращивание посевного материала без отбора суспензии продолжается 8— 9 ч, при интенсивной аэрации и постоянном доливе питательной среды (170-200 л/ч), до накопления в ферментере биомассы в количестве 4-5 г АСВ/л. После этого засевную культуру начинают отбирать на основное производство в количестве 1,3—1,7 м³/ч при одновременном доливе питательной среды.

Процесс ферментации длится от 5 до 10 суток, а затем цикл приготовления посевного материала возобновляется. К подготовительным стадиям производства относится приготовление растворов питательных солей и микроэлементов, необходимых для нормального развития микроорганизмов. Этот участок имеет свою технологическую схему. Обычно набор минеральных компонентов группируют в два раствора, которые параллельно подаются в основной ферментатор: раствор всех макроэлементов (N, Р, К), необходимое количество которых составляет 5-70 г/л; раствор микроэлементов (Mg, Mn, Fe, Zn и т.д.), концентрации которых не превышают 5-10 мг/л.

Технологические потоки из всех подготовительных отделений (компримирование воздуха, хранение и подготовка сырья, получение засевной культуры, приготовление растворов питательных солей и микроэлементов, технологическая вода, аммиачная вода, стерильная культуральная жидкость) поступают на главную стадию производства - стадию ферментации. Основным аппаратом в этом отделении является ферментатор - аппарат полного смешения по жидкой фазе, обеспечивающий:

рост и развитие популяций микроорганизмов в объеме жидкой фазы;

транспорт питательных веществ к клеткам микроорганизмов;

отвод от микробных клеток продуктов их обмена;

отвод из среды тепла как результат жизнедеятельности клеток.

Затем следуют другие этапы технологической схемы получения кормовой биомассы:

♦ сгущение суспензии микроорганизмов. При этом концентрация биомассы повышается до 12-16 % ЛСВ за счет механического отделения большей части межклеточной влаги за минимальное время. Для этого используют сепараторы, а также флокуляцию, коагуляцию, флотацию или декантацию;

♦ термообработка суспензии. При нагревании микроорганизмов до температуры 75-85 °С в течение 10-40 мин происходит гибель штамма-продуцента и практически всей сопутствующей микрофлоры;

♦ концентрирование суспензии в отделении выпаривания до концентрации 23-25 % АСВ. Для этого используется 3- корпусная вакуум-выпарная установка: в первом корпусе температура 90 °С, втором —75 °С и третьем - 60 °С.

♦ сушка. В этом отделении происходит образование готового продукта с влажностью ~ 10 % (по массе). Для этого чаще всего используются конвективные сушилки (распылительные, кипящего слоя, ленточные и барабанные);

♦ грануляция и сушка обычно сухая биомасса, содержащая 8-10 % (по массе) влаги, представляет собой готовый продукт и после упаковки направляется на склад к потребителю. Если продукт необходимо получить в виде гранул, то сухая и влажная (после выпарки) биомасса в соотношении 1:1 поступает в гранулятор. При этом влажная биомасса налипает на сухие частицы и вся масса влажностью 45-50 % движется в аппарате, формируя гранулы, которые затем подаются в сушилку кипящего слоя. Гранулы подсушиваются до остаточной влажности 8-10 % (по массе) горячим воздухом или топочными газами с температурой 260-300 °С;

♦ фасовка и упаковка готового продукта. Сухая биомасса поступает в приемный бункер и фасуется массой 25-30 кг в бумажные мешки с клапаном. Эти мешки укладываются на специальные поддоны, которые отвозят на склад или отгружают потребителю.

Обязательной стадией получения белковых веществ является процесс очистки газовоздушных выбросов (ГВВ). Они представляют собой большие объемы воздуха, содержащего живые клетки микроорганизмов, белковую пыль, другие продукты микробного синтеза. ГВВ подаются вентилятором в трубу Вентури, где смешиваются с водой, вводимой под давлением. Вода, распыляясь, образует мельчайшие капли, на которых происходит адсорбция примесей и их частичная коагуляция. Затем газ в инерционном аппарате частично отделяется от жидкости, проходит циклон-каплеотделитель и очищенный воздух направляется в дымовую трубу или выбрасывается в атмосферу. Загрязненная вода поступает в отстойник, где отделяется большая часть примесей. Более чистая вода подается на повторное орошение трубы Вентури, а загрязненная (15-25 %) поступает на водоочистку.

Перспективы использования биомассы. Крупномасштабное культивирование промышленных микроорганизмов и использование их биомассы - один из основных источников белка для человека и животных. Сырьевая база микроорганизмов практически неисчерпаема, рост биомассы быстрый и интенсивный, состав белка одноклеточных весьма постоянен, он, как правило, сбалансирован по аминокислотному составу.

Из биомассы промышленных микроорганизмов можно получать широкую гамму продуктов различного назначения, имеющую важное значение в хозяйственной деятельности человека.

Биопродукты

Цистеин, метионин, лизин - обеспечивается повышение питательной ценности белков:

Биомасса промышленных микроорганизмов уже сейчас широко используется для получения микробных препаратов (удобрителей почв, стимуляторов и регуляторов роста растений) и микробных полимеров (ферментных белков, иммунобиологических препаратов, интерферонов, антибиотиков, гормонов и т.д.).    

Производство ферментных препаратов различного назначения. Биотехнологическая промышленность условно делится на крупнотоннажное производство и производство продуктов тонкого биосинтеза. Производство этанола, кормовых и хлебопекарных дрожжей, органических кислот и аминокислот, органических растворителей, полисахаридов и ферментов относится к крупнотоннажному. К тонкому синтезу относят производство антибиотиков, гормонов, медицинских (очищенных) ферментов, фармацевтических препаратов, различных биохимических реактивов.

Ферменты, используемые в промышленных или полупромышленных процессах, за исключением папаина, который экстрагируют из плодов папайи и который служит размягчителем мяса, имеют микробное происхождение. В наибольших количествах производят четыре фермента. В 1980 г. было произведено 530 т протеаз, 350 т глюкоамилазы, 320 т а-амилазы и 70 т глюкоизомеразы. Области промышленного использования микроорганизмов и применения основных микробных ферментов следующие:

♦ производство сбраживаемых алкогольных напитков и пищевых продуктов (соевый соус, уксус, маринованные овощи, сыры, йогурт, молочнокислые напитки, пиво, сидр, вино, сакэ и др.);

♦ производство физиологически активных веществ (вакцины и микробные биоинсектициды, пекарские и кормовые дрожжи, аминокислоты, мононуклеотиды, витамины, стероиды, каротиноиды, гиббереллины и другие гормоны роста растений);

♦ производство растворителей и органических кислот (этанол, бутанол, ацетон, уксусная, лимонная, фумаровая и молочная кислоты);

♦ производство полисахаридов (декстраны, леваны, маннаны, ксантаны);

♦ производство антибиотиков (пенициллины, стрептомицины, канамицины, неомицины, тетрациклины, бацитрацин и др.);

♦ уменьшение загрязнения (обработка промышленных стоков, жидких отходов, уничтожение отходов и мусора и др.);

♦ микробное выщелачивание руд и утилизация горнорудных отходов;

♦ использование в сыроварении (прессованный творог, мягкие, полумягкие, твердые и очень твердые сыры и др.).

Все возрастает роль ферментов в медицинской диагностике. Например, для определения в сыворотке крови холестерина, глюкозы, мочевой кислоты и др. Пренатальную диагностику серповидноклеточной анемии можно осуществить, обрабатывая рестриктазами ДНК зародышевых клеток амниотической жидкости. В этом случае исключается отбор проб крови зародыша.

Технологически важно, что некоторые микроорганизмы выделяют ферменты из клеток в окружающую среду, это облегчает выделение и очистку. К экскретируемым ферментам относятся гидролизы, амилазы, протеазы, целлюлазы и др. Механизмы экскреции таких больших молекул, как ферменты, еще до конца не изучены. Возможно, ферменты выделяются в окружающую среду путем экзоцитоза.

Выделение ферментов из биомассы является сложным процессом. Для превращения растворенного фермента в форму нерастворимых частиц существует несколько методов: высаливание, осаждение путем изменения температуры и pH, осаждение растворителями, при помощи высокомолекулярных полимеров, ионами металлов и комплексов. Например, для осаждения а-амилазы в биореактор при перемешивании среды добавляют значительные количества этанола. После декантации осадок уплотняют в пресс-фильтре и сушат в вакуумной сушилке. При этом из 5000 л среды получают 73,5 кг препарата с высокой активностью. Затем его стандартизируют гипсом до получения нужной активности.

Технологические процессы производства ферментных препаратов молено разделить на 2 группы. В первом случае ферментация ведется глубинным методом в жидкой питательной среде, во втором - используется поверхностная культура, растущая на специально подготовленной рыхлой и увлажненной питательной среде.

Основные этапы глубинного метода культивирования продуцентов ферментов:

♦ получение посевного материала по схеме: исходная культура продуцента → маточная культура, выращенная в колбах на качалке, → посевная культура, выращенная в инокуляторе, → посевная культура, выращенная в посевном аппарате. Объем посевного аппарата обычно составляет до 10 % от объема промышленного ферментатора;

♦ приготовление питательных сред;

♦ стерилизация питательных сред с помощью мембран или высоких температур;

♦ очистка воздуха до и после аэрирования;

♦ производственное культивирование. Здесь необходимо проводить учет увеличения биомассы, накопления ферментов, изменения состава питательной среды, ее кислотности, аэрации и т.д.

Глубинный метод более совершенен, чем поверхностный, так как легко поддается механизации и автоматизации, легче и проще осуществляется переход к большим масштабам производства. Этот процесс должен проходить в строго асептических условиях. Однако концентрация ферментов в среде при глубинном культивировании обычно значительно ниже, чем в водных экстрактах поверхностной культуры.

При поверхностном методе культура растет на поверхности твердой увлажненной питательной среды. Недостатками метода являются: необходимость иметь большую поверхность контакта рыхлой среды с воздухом, что часто отражает неинтенсивный характер процесса; мойка, стерилизация, перемещение кювет с небольшой высотой слоя, их заполнение и освобождение, что требует больших затрат ручного труда; выращивание культуры проходит в неасептических условиях.

Преимущества поверхностного метода: более высокая конечная концентрация фермента на единицу массы среды, такие культуры легко выращивать и приводить в товарную форму; снижена потребность в электроэнергии и т.д.

Культура микроорганизмов, выращенная поверхностным методом, и культуральная жидкость после глубинного культивирования содержит большое количество балластных веществ: биомассу продуцента, непотребленные компоненты среды, продукты метаболизма Доля собственно ферментов составляет около 1 % для поверхностных и не более 0,1 % - для глубинных культур.

Выделение и очистка ферментов - трудоемкий и дорогой процесс. Поэтому в кожевенной, спиртовой промышленности, для введения в корма животных применяют ферментные препараты в неочищенном виде. В то же время в пищевой промышленности, текстильных, микробиологических производствах, медицине должны использоваться только высокоочищенные ферменты. В результате очистки происходит повышение удельной активности препарата. Это очень важный момент и для его реализации применяют множество препаративных методов в нестандартной последовательности и в самых разных комбинациях. Принципиально технология получения очищенных ферментов включает следующие этапы:

экстракцию из поверхностной культуры;

отделение твердой фазы;

концентрирование ферментных растворов; ультрафильтрацию;

осаждение органическими растворителями;

высаливание;

сорбционную очистку;

сушку;

стандартизацию ферментных препаратов.