Общая биотехнология: Курс лекций Часть II - Блинов В.А. 2004
Многотоннажное микробиологическое производство аминокислот и органических кислот
♦ Производство аминокислот.
♦ Производство органических кислот: молочной, лимонной и уксусной.
♦ Другие органические кислоты.
Производство аминокислот. Этому вопросу во всем мире уделяется особое внимание, ибо дефицит аминокислот, нарушая биосинтез белка, тормозит рост и развитие, может вызвать различного рода заболевания. В то же время включение в рацион животного несколько десятков долей процента дефицитной аминокислоты повышает кормовую ценность белка более чем в 2 раза В настоящее время производство аминокислот составляет свыше 500 тыс. т в год, из них глутаминовой кислоты производится 200 тыс. т, метионина - 160 тыс. т, лизина - 50 тыс. т и т.д. Аминокислоты производятся и микробиологическим (~ 60 %), и химическим путем. Так, химическим синтезом получают D,L-мет ионии из акролеина DL-триптофан из индола и нитроуксусного эфира L-глутамат натрия из акрилонитрила L-лизин из циклогексанона и др. Однако при химическом синтезе всегда образуются рацематы - смеси D- и L-аминокислот, для разделения которых нужна сложная и дорогостоящая очистка, D-аминокислоты являются балластом, так как не усваиваются организмом человека и животного, повышают расходные коэффициенты используемого сырья на 1 т продукции, некоторые из них токсичны. Исключение составляет глицин, у которого нет оптически активных изомеров и метионин, DL-формы которого усваиваются организмом в равной мере.
С 50-х годов XX века известна способность ауксотрофных мутантов Brevibacterium, Micrococcus, Corynebacterium и др. к сверхсинтезу экстрацеллюлярных аминокислот. Это явилось основанием для создания крупнотоннажного производства L- амшюкислот. Так, генноинженерные штаммы-продуценты на основе Е. coli позволяют за 40 ч ферментации накапливать в среде до 30 г/л L-треонина, до 27 г/л L-пролина, до 22,4 г/л L-фенилаланина.
Известны два способа получения аминокислот: одноступенчатый и двухступенчатый. По первому способу мутантный по- лиауксотрофный штамм-продуцент аминокислоты культивируют на оптимальной для биосинтеза среде. Целевой продукт накапливается в культуральной жидкости, из которой его выделяют. В двухступенчатом способе на первой ступени микробпродуцент аминокислоты культивируют в жидкой питательной среде, где происходит биосинтез предшественников аминокислоты (заготовка) и ферментов, катализирующих образование целевого продукта. На второй ступени целевой продукт (аминокислота) синтезируется с помощью этих ферментов.
В наибольших количествах микробиологическим путем получают глутаминовую кислоту, с помощью указанных выше бактерий. В основе сверхсинтеза этими бактериями глутаминовой кислоты из глюкозы лежат два биохимических принципа: недостаток а-кетоглутаратдегидрогеназы и блокировка биосинтеза биотина При лимите в среде биотина (1-5 мкг/л), а также при введении антибиотиков и детергентов нарушается нормальный синтез фосфолипидов мембраны и она становится более проницаемой для глутамата Если используются ауксотрофные мутанты со слабой активностью а-кетоглутаратдегидрогеназы (фермент включает предшественник глутаминовой кислоты в цикл трикарбоновых кислот), то накапливается кетоглутарат, который неспособен к превращениям в ЦЛК. Бактериальный синтез глутамата позволяет получать 50 %-й выход продукта из сахара и накапливать в среде ферментации до 200 г/л глутамата Известны методы получения глугамата на этанольных средах (до 60 г/л) или ацетате (до 98 г/л).
Приведем технологию получения L-глутаминовой кислоты, Это заменимая аминокислота, но на ее основе синтезируются многие БАВ, необходимые для нормальной жизнедеятельности человека. Глутамат натрия широко применяется как добавка к пище для улучшения ее вкусовых качеств, а также для сохранения этих свойств продуктов при длительном хранении в консервированном и замороженном состоянии. В медицине глутаминовая кислота используется при лечении заболеваний, связанных с отравлением печени и почек.
Одноступенчатый способ. Посевной материал от пробирок до посевного аппарата выращивают в строго асептических условиях по 24 ч. Для промышленных штаммов Corynebacleriutn glutamicum состав питательной среды при производстве посевного материала (в %): меласса - 8; кукурузный экстракт - 0,3; хлорид аммония - 0,5; фосфат калия двухзамещенный 0,05; сульфат магния - 0,03; вода - до 100 %; pH среды - 7,0-7,2. На стадии биосинтеза в питательную среду вместо кукурузного экстракта и сульфата аммония вводят до 2 % мочевины, содержание мелассы увеличивают до 20 %, дополнительно вводят мел до 1 % и 0,1 % синтетического пеногасителя.
Накопление биомассы до 6-8 г АСВ/л производят в аэробных условиях сначала в инокуляторах объемом 2 м3, потом в посевных аппаратах объемом 5 м3. Биосинтез осуществляют в строго асептических условиях в ферментаторах объемом 50 м3 с коэффициентом заполнения аппарата 0,7 в течение 48-52 ч и интенсивной аэрации - 80-85 мг О2/(л-мин). Это соответствует расходу 1 объема воздуха на 1 объем среды в 1 мин. Температура культивирования на всех стадиях должна быть постоянной - 28-30 °С. В конце процесса культуральная жидкость содержит до 45 г/л глутаминовой кислоты. Ее выход по отношению к потребленным сахарам составляет 45-50 %.
Для получения глугаминовой кислоты в качестве пищевых добавок или в виде лекарственных форм технологическую схему дополняют следующими этапами:
♦ предварительная обработка культуральной жидкости. Для этого в нее добавляют негашеную известь или известковое молоко, с последующим осаждением ионов кальция фосфорной кислотой. Осадок способствует лучшему отделению клеток продуцента и других балластных примесей;
♦ отделение осадка. Используют центрифугирование или фильтрацию под давлением;
♦ осветление фильтрата - обработка активированным углем или ионнообменная сорбция на анионите;
♦ концентрирование осветленною раствора. Для этого проводят вакуум-выпаривание при температуре 40-60 °С, в результате из исходного раствора отгоняется 50-80 % воды;
♦ осаждение кристаллов глутаминовой кислоты в изоэлектрической точке: используют подкисление концентрата соляной кислотой до pH 3,2 (это изоэлектрическая точка глутаминовой кислоты) и охлаждение раствора до 4—15 °С. Такое однократное воздействие обеспечивает кристаллизацию 77 % глутаминовой кислоты, при повторном воздействии выход возрастает до 87 %. Последующей перекристаллизацией чистоту кристаллов можно увеличить до 99,6 %, что соответствует требованиям фармакопеи;
♦ отделение кристаллов глутаминовой кислоты от маточника Для этого используют центрифутирование, декантанцию и возврат маточника на стадию вакуум-выпаривания. Кристаллы промывают обессоленной водой и направляют на сушку;
♦ сушка проводится в вакууме или в токе нагретого воздуха при 60-70 °С;
♦ получение глутамата натрия. Для этого влажные кристаллы неперекристаллизованной глутаминовой кислоты обрабатывают гидроксидом натрия с последующими этапами согласно НТД.
В соответствии с требованиями МРТУ 18/210-68 глутамат натрия пищевой должен иметь следующий состав (в %): основное вещество - не менее 94, хлорид натрия - не более 5, влага - не более 1, общий азот - не менее 7,02.
Двухступенчатый способ. Для этого используют два варианта:
В этом способе продуцентами а-кетоглутаровой кислоты являются Pseudomonas, Escherichia, Kluyverd citrophila и Candida. Продуцентами ферментов могут быть различные микроорганизмы, например, Е. coli. Донором аминогрупп служат аспарагиновая кислота или аланин.
Принципиально аналогичной является технология получения L-лизина и кормовых препаратов на его основе. Лизин в организме человека и животных определяет биологическую ценность перевариваемого белка, способствует секреции пищеварительных ферментов и транспорту кальция в клетки, улучшает азотистый баланс. В основном весь лизин, производимый в мире микробиологическим синтезом, расходуется на обогащение кормов сельскохозяйственных животных и птицы. Он используется в виде жидкого концентрата лизина (ЖКЛ), кормового концентрата лизина (ККЛ), высококонцентрированных кормовых препаратов лизина. Кристаллические высокоочищенные препараты лизина представляют собой L-лизин монохлоргидрат с содержанием основного вещества 97-98 %, влажность его 0,5 %, зольность 0,3 %, температура плавления 210 °С.
Завершает процесс производства аминокислот фасовка (полиэтиленовые мешки), упаковка и складирование готового продукта.
Экономически оправданным является получение аминокислот при помощи иммобилизованных ферментов и клеток. Так, сырьем для производства L-аспарагиновой кислоты служит фумаровая кислота (продукт микробного синтеза) и аммиак. Иммобилизованные бактериальные клетки, обладающие аспартазной активностью, катализируют присоединение аммиака по двойной связи фумаровой кислоты. Если клетки продуцента иммобилизовали в геле, то время их полуинактивации составляло 4 месяца. Технологию биотрансформации фумаровой кислоты можно представить следующим образом:
♦ выращивание клеток методом глубинной ферментации и их выделение центрифугированием;
♦ иммобилизация клеток биокатализатора в геле в виде гранул размером 2-3 мм;
♦ биотрансформация фумарата аммония в колонке с катализатором в проточном режиме и получение L-аспарагиновой кислоты;
♦ кристаллизация, центрифугирование и промывка кристаллов.
Микробиологическим путем получают фенилаланин, либо при помощи тирозин- и метиониндефицитного мутанта Brevibacterium lactofermentum, либо при помощи ауксотрофного мутанта Е. coli, который можно культивировать в глюкозной среде с фосфатами, являющейся менее сложной и дорогой, чем в первом варианте. Фенилаланин служит сырьем для пищевого подсластителя аспартама, он слаще сахарозы в 200 раз.
Производство органических кислот: молочной, лимонной, уксусной. Многие из таких кислот технического назначения выгодно получать химическим путем. Органические кислоты используются в пищевой, химической, фармацевтической, легкой промышленности, в быту. Так, годовой объем производства лимонной кислоты составляет 400000 т, сырьем являются меласса и н-алканы, выход продукции составляет 85-140 %, продуцентами являются Aspergillus niger и Candida lipolytica. Для молочной кислоты эти параметры следующие: 30000 т, глюкоза 90 %, Lactobacillus delbrueckii; для уксусной (10 %-я): 10 млн м3, этанол 90-98 %, Acetobacter aceti; для пропионовой кислоты - неизвестно, глюкоза 60 %, Propionibacterium Shermanii.
Микробиологические процессы получения органических кислот можно разделить на две группы: анаэробные (молочная, пропионовая) и аэробные (уксусная, лимонная, итаконовая, глюконовая). Все органические кислоты являются промежуточными или конечными продуктами катаболизма углеводов. Аэробное получение органических кислот реализуют как глубинным, так и поверхностным методами ферментации, а анаэробные - глубинными.
Получение молочной кислоты. Молочнокислые бактерии относятся к 4 родам: Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus и Pedicoccus. Род Lactobacillus включает три подрода - Thermobacterium, Streptobacterium и Betabacterium. Первые из них не растут при 15 °С, но выдерживают температуры выше 50 °С. Стрептобактерии не являются термофильными. Бетабактерии образуют D,L-молочную кислоту из глюкозы. Термострептобактерии, стрептококки и педикокки гомоферментативные, т.е. образуют из гексоз преимущественно молочную кислоту; бетабактерии и лейконостоки — гетероферментативные. Они наряду с молочной кислотой образуют уксусную кислоту, диоксид углерода и этанол. В качестве субстрата молочнокислые бактерии могут использовать мальтозу, лактозу, глюкозу, осахаренный крахмал и др. Среда для них должна также содержать витамины группы В, аминокислоты, пурины, пиримидины, органические кислоты и др. В промышленном производстве чаще всего используют термофильные гомоферментативные виды. Например, L. delbrueckii штамм Л-3, у которого выход молочной кислоты составляет 95-98 % от потребленной сахарозы.
Технологическая схема получения L(+)-молочной кислоты следующая. Мелассную среду, содержащую 5-20 % сахара, вытяжку солодовых ростков, дрожжевой экстракт, витамины, фосфат аммония, засевают L. delbrueckii. Брожение протекает при 49-50 °С при исходном pH, равном 6,3-6,5. По мере образования молочной кислоты среду периодически нейтрализуют мелом. Весь цикл ферментации завершается за 5-10 дней; при этом в культуральной жидкости содержится 11-14 % лактата кальция и 0,1—1,5 % сахарозы. Клетки бактерий и мел отделяют фильтрованием (отход), фильтрат упаривают до концентрации - 30 %, охлаждают до 25 °С и подают на кристаллизацию, которая длится 1,5-2 суток. Кристаллы лактата кальция обрабатывают серной кислотой при 60-70 °С, гипс выпадает в осадок, а к надосадочной жидкости добавляют желтую кровяную соль при 65 °С для удаления ионов железа, затем натрий сульфат для освобождения от тяжелых металлов. Красящие вещества удаляют с помощью активированного угля. После этого раствор молочной кислоты подвергают вакуум-упариванию до 50 % или 80 %. Такую, не до конца очищенную, молочную кислоту используют для технических целей. Более очищенную молочную кислоту можно получить при перегонке ее сложных метильных эфиров, при экстракции простым изопропиловым эфиром в противоточных насадочных колоннах.
Лактат широко используется в качестве подкислителя при производстве джемов, желе, кондитерских изделий, наливок, экстрактов, при консервировании овощей. Молочную кислоту применяют для регулирования pH пивного сусла, в кожевенной, текстильной, фармацевтической промышленности, для изготовления растворителей и пластификаторов, лаков, олиф, для приготовления моющих средств, отделки натуральных тканей. Однако следует помнить, что молочная кислота является сильным коррозирующем агентом.
Гомо- и гетероферментативмые молочнокислые бактерии давно используются в хлебопечении. Их ассоциации с дрожжами, благоприятные для создания аромата, вкуса, пористости, окраски и свежести, называют заквасками. Молочнокислое брожение лежит в основе силосования кормов и квашения овощей (капусты, огурцов), плодов, ягод (маслин, яблок). Лактобактерии лежат в основе приготовления кисломолочных продуктов, творога, сыров. Наконец, молочнокислые бактерии входят в состав профилактических и лечебных препаратов (бифидумбактерин, бификол, колибактерин, лактобактерин). Лактобактерии антагонистичны гнилостным, уксуснокислым, маслянокислым бактериям, энтеробактериям, но не дрожжам.
К современным относят метод получения молочной кислоты при помощи Streptococcus thermophiliis в биореакторе, работающего по принципу «кипящего» или псевдоожиженного слоя. В этом слое перемещаются шарики активного угля, покрытые биофильмом. В нижней части уголь сорбирует субстрат, а в верхней - молочную кислоту. Среда содержит глюкозу, дрожжевой экстракт, ацетат натрия, двузамещенный цитрат аммония, двузамещенный фосфат калия, сульфаты магния и марганца Продуктивность системы составляет 12 г/(л∙ч) молочной кислоты.
Получение лимонной кислоты. Раньше лимонную кислоту получали из цитрусовых растений. В настоящее время разработаны поверхностные и глубинные методы культивирования микробов-продуцентов. Сейчас в производстве применяют селекционированные штаммы A. niger, в частности, штамм P-З, дающий выход лимонной кислоты 98-99 % в расчете на потребленную сахарозу. Штамм обладает высокой осмотолерантностью (до 12 % сахара в питательной среде). Основным сырьем для производства лимонной кислоты является меласса, в которой всегда много железа. Его осаждают с помощью желтой кровяной соли - K4[Fe(CN)6]. В отдельном цехе нарабатывают споры (конидии) гриба в три стадии. В первой стадии A. niger выращивают на скошенной агаризованной среде в пробирках, во второй и третьей стадиях его размножают на плотной или жидкой среде в колбах Эрленмейера или алюминиевых кюветах площадью 8,5-12 дм2, с высотой бортиков от 7 до 20 см. Продолжительность каждой стадии 2-4 суток при температуре 32 °С. При образовании и созревании конидий бесцветный мицелий становится черным. Конидии собирают аспирацией вакуумным насосом, подсушивают в термокамере при 28-30 °С, смешивают со стерильным активированным углем (1:2), фасуют в стерильные флаконы и хранят 1,5-2 года С 10 дм2 питательной среды в кюветах можно получить до 4-5 г сухих конидий.
Поверхностный способ жидкофазной ферментации. Производство лимонной кислоты осуществляют в «бродильных камерах». На стеллажи помещают 8-10 кювет одну над другой. На дне каждой кюветы имеется сливной штуцер. Эти камеры оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией, которая обеспечивает равномерный приток стерильного воздуха заданной температуры и влажности (3-4 м3/м2 мицедня∙ч1). Температура в камерах 34-36 °С, высота питающего слоя жидкой мелассной среды 6-12 см.
Максимальное тепловыделение достигается к 5 суткам (500-550 кДж/м2∙ч), исходная концентрация сахара равна в среднем 12 %. В течение первых суток pH от 6,8-7,0 снижается до 4,5, а к 8-9 суткам - до 3,0. В таких условиях максимальное кислотообразование происходит на 5-6 сутки и затем устанавливается на уровне 50-60 г/м2-ч∙1. Обычно через 6-7 суток от начала ферментации, когда концентрация сахара снижается до 3-4 %, доливают стерильный раствор мелассы без питательных солей - 30-35 % начального объема. Таким приемом продлевают ферментацию до 12 суток, а количество перерабатываемой среды для получения целевого продукта возрастает на 30-35 %.
В собранной культуральной жидкости содержится смесь лимонной, глюконовой, щавелевой кислот и неиспользованный сахар в соотношении 40-50:3:1:7, т.е. содержание лимонной кислоты от 80 до 90 %. Для ее выделения к нагретой до 100 °С культуральной жидкости добавляют известковое молоко (Са(ОН)2) или мел (СаСО3), доводят pH до 6,8-7,0. Трехзамещенный кальция цитрат, хуже растворимый в горячей воде, чем в холодной, выпадает в осадок вместе с оксалатом кальция. Осадок отфильтровывают, промывают горячей водой и гидролизуют серной кислотой, при этом свободная лимонная кислота остается в растворе. Этот раствор очищают, подвергают вакуум-упариванию и кристаллизуют. Кристаллы кислоты высушивают и фасуют.
Твердофазная ферментация. Метод достаточно прост. Ферментацию штамма A. niger проводят на увлажненных отрубях риса или пшеницы, находящихся в кюветах. Условия такие же, как и при использовании агаризованных или жидких питательных сред. После завершения культивирования отруби экстрагируют водой, в которую переходят кислоты. Затем выделяют цитрат кальция и чистую лимонную кислоту по схеме, приведенной выше.
Глубинный способ производства лимонной кислоты экономически выгоден, если мощность завода превышает 2,5 тыс. т кислоты в год. Для его реализации используют специальные культуры A. niger - в России это № 288/9. Сначала выращивают конидии. Затем инокулят подращивают в инокуляторе и в посевном аппарате на среде с 3-4 % сахара. Спустя 1-1,5 суток инокулюм передают из посевного в основной ферментатор и процесс ведут в течение 5-7-10 суток, с трехразовым доливом 25-28 % (по сахару) раствора мелассы, чтобы довести конечную концентрацию сахара до 12-15 %. После окончания ферментации, т.е. снижения кислотообразования, мицелий гриба отфильтровывают, а культуральную жидкость обрабатывают по схеме.
В настоящее время налажено производство лимонной кислоты путем биосинтеза ее дрожжами, выращиваемыми на парафинах и низших спиртах (этанол). Выход продукта составляет 80-140 %.
Лимонная кислота усиливает деятельность поджелудочной железы, возбуждает аппетит и стимулирует усвоение пищи. Лимонную кислоту используют в кулинарии, а также в производстве безалкогольных напитков, мармелада, вафель, пастилы. Она включена в рецептуры некоторых сортов колбас и сыра. Ее применяют в виноделии, для рафинирования растительных масел, производства сгущенного молока. Она сохраняет естественный вкус и аромат при длительном хранении в замороженном состоянии мяса и рыбы.
Ее применяют для приготовления шампуней и моющих средств. Последнее имеет важное экологическое значение, так как лимонная кислота легко поддается микробиологической деградации при очистке канализационных вод.
Мицелий продуцента лимонной кислоты используют для выделения фермента пектиназы, а также флавинов или высушивают и поставляют на корм скоту и домашней птице.
Получение уксусной кислоты. [Уксус был известен за 7 тыс. лет до н. э. Уксуснокислое брожение вызывают Acctobacter oxidans, A. aceti, А. хуlіnum и др. Однако чтобы развилось уксуснокислое брожение, сахар субстрата сначала должен превратиться в этиловый спирт, т.e. уксуснокислому брожению предшествует спиртовое. Спиртовое брожение лучше всего осуществляют селекционированные штаммы винных дрожжей (Saccharomyces ellipsoideus). Они, кроме этанола, образуют побочные продукты обмена, улучшающие вкус и аромат уксуса. Уксус различается по сортам в зависимости от характера сбраживаемого субстрата, например, яблочный, виноградный, грушевый и другие сорта уксуса. Аромат и вкус уксуса обуславливают сложные эфиры (этилацетат и др.), высшие спирты, органические кислоты.
Обычно уксуснокислые бактерии иммобилизуются (адсорбируются) на древесной стружке, древесном угле, коксе и т.д. Пропуская раствор этанола через такие генераторы, получают 10-15 %-й раствор уксусной кислоты. На практике из 100 л этанола получают 90 л уксусной кислоты.
Ежегодно во всем мире производят более 100 тыс. т уксусной кислоты. Половину из этого количества получают химическим путем в виде технической уксусной кислоты. Ее используют для производства ацетона, ацетилена, синтетических красителей, медицинских препаратов (аспирин, антипирин, фенацетин), ароматизирующих веществ (кумарин, ванилин), в качестве субстрата для микробиологической биотрансформации. Особенно широко уксусная кислота применяется в пищевой промышленности. Продуцент уксусной кислоты из рода Acetobacter, развиваясь на поверхности среды, образует слизистую пленку, которая состоит из целлюлозы (90 %) и клеток бактерий. Эту пленку снимают, высушивают, обрабатывают и получают биофильмы медицинского назначения. Если ожоговые раны покрыть такими биофильмами, то они заживают в течение 7-8 суток.
Другие органические кислоты. Источником углерода для пропионовых бактерий является глюкоза. Пропионовые бактерии - грамположительные, бесспоровые, неподвижные палочки. Все они относятся к семейству Propionibacteriacae. Для производства пропионовой кислоты используют Р. freudenreichii и Р. acidipropionici, а для получения витамина В12— Р. freudenreichii u Р. acne.
Биосинтез кислоты проводят на простых средах, например, (в %): углевод - 1-2, аммония сульфат - 0,3, гидрофосфат калия - 0,2, кобальта хлорид - 0,0001, биотин - 0,00001, пантотенат - 0,1, тиамин - 0,01. Все шире используется биосинтез пропионовой кислоты клетками иммобилизованными в геле, например, ПААТ.
Часто пропионат и ацетат, как конечные продукты ферментации, не разделяют, так как обе кислоты обладают консервирующими свойствами. Отделенные клетки используют для получения супероксиддисмутазы (СОД), каталазы, пероксидазы и витамина В12. Высушенный экстракт в виде порошка используют в пищевой промышленности как антиоксидант и витаминизированный препарат.
Глюконовая кислота продуцируется штаммами Aspergillus niger, которые культивируются в ферментаторах при интенсивной аэрации и перемешивании, температура должна быть постоянной (30 °С), а pH среды 6,0-7,0. Аппаратурное оформление технологического процесса получения глюконовой кислоты близко к производству лимонной кислоты глубинным методом.
Мицелий гриба используют для выделения глюкозооксидазы, которая применяется в пищевой и фармацевтической промышленности. Селекционированный штамм A. niger продуцирует почти одну глюконовую кислоту, поэтому для ее выделения культуральную жидкость отфильтровывают от мицелия, упаривают и высушивают. Глюконовую кислоту и ее соли широко применяют на практике. Так, глюконат кальция ускоряет свертывание крови, глюконат натрия используется для изготовления моющих средств, глюконовую кислоту применяют в фотографии, литографии, при изготовлении красок, для очистки металлов и т. д.
Итаконовую кислоту продуцируют Aspergillus itaconjcus u A. terreus. Технологический процесс получения итаконовой кислоты сходен с процессом получения лимонной кислоты - ферментацию продуцента осуществляют поверхностным или глубинным методом. Итаконовую кислоту применяют в химическом синтезе высококачественных смол, волокон типа питрон, детергентов, лекарственных веществ, красителей и другая органических соединений.
Яблочная кислота применяется в органическом синтезе, например, в синтезе урацила. Ее получают химическим путем из малеиновой кислоты или же путем микробиологического синтеза. В результате химического синтеза образуется рацемическая смесь D,L-яблочной кислоты, а нужен, как известно, L-изомер. Его получают из фумаровой кислоты при помощи иммобилизованной фумаразы, которая присоединяет воду с образовавшем L-яблочной кислоты. Для этого не требуется изолированный фермент, а только клетки, содержащие фумаразу. Японские фирмы в качестве носителя клеток используют гель каррагинана - полисахарида морских водорослей. Гранулы иммобилизованных клеток загружают в колонну, через которую пропускают раствор фумаровой кислоты. На выходе из колонны получают раствор L-яблочной кислоты. Период инактивации такой колонны составляет 160 суток.