Биотехнология - Ю.О. Сазыкин 2006

Частная биотехнология
Лекарственные препараты, получаемые в фармацевтической промышленности биотехнологическими методами
Витамины

Витамины представляют низкомолекулярные органические соединения, необходимые для жизнедеятельности организма, синтез которых в организме либо ограничен, либо отсутствует. Не подлежит сомнению исключительно высокая биологическая активность витаминов. Потребность в них для организма человека вполне достаточна в очень небольших количествах (от нескольких микрограммов до нескольких десятков миллиграммов в день).

Витамины, не являясь пластическим материалом или источником энергии, служат активными биокатализаторами разных метаболических процессов в организме. Почти все водорастворимые витамины, а также жирорастворимый витамин К являются коферментами или кофакторами биохимических реакций. Витамины A, D, Е регулируют генетический аппарат клетки. Помимо этого абсолютно каждому витамину свойственна своя, специфическая функция в организме. Все это указывает на незаменимость витаминов для жизнедеятельности организма.

В современных социально-экономических условиях вследствие индустриализации и достижений цивилизации человек изменил характер питания и стал употреблять много рафинированных и консервированных продуктов, обладающих меньшей витаминной ценностью. В качестве примера можно привести муку высших сортов, при производстве которой теряется до 80—90 % всех витаминов. Другой пример, при операции экстрагирования, дезодорирования и осветления растительных масел разрушаются жирорастворимые витамины. Витамины А, Е, К и каротин достаточно устойчивы к термообработке, но весьма чувствительны к свету и кислорода воздуха.

Для стран со слабо развитой экономикой дефицит витаминов приобретает массовое явление вследствие достаточно низкого прожиточного минимума для большинства населения этих стран, одновременно с этим снижается качество питания из-за отсутствия в нем свежих овощей, фруктов, мяса, рыбы.

Широкое распространение полигиповитаминозов, снижение резистентности организма к болезнетворным микроорганизмам, сопровождающееся вредными экологическими факторами (радиацией, канцерогенами, промышленными токсинами) — все это повышает роль витаминов в профилактической и лечебной работе врачей, поэтому в экономически развитых странах стали реализовываться государственные программы искусственной витаминизации пищевых продуктов (муки, хлеба, молока, соков и др.).

В основе классификации витаминов (табл. 1) находятся их физико-химические свойства, в соответствии с которыми все витамины делят на водо- и жирорастворимые.

Известно, что водорастворимые витамины в тканях не накапливаются (за исключением витамина В₁₂), из чего следует необходимость их ежедневного поступления в организм. Жирорастворимые витамины способны накапливаться в тканях, поэтому их недостаточность или дефицит встречаются реже. Для них не свойственна и коферментная функция (кроме витамина К). Интересно, что, выполняя функцию индукторов синтеза белков, представители жирорастворимых витаминов проявляют сходство со стероидными гормонами, особенно это имеет отношение к витамину D. И, наконец, все жирорастворимые витамины являются структурными компонентами клеточных мембран, проявляя антиоксидантное действие. Обращаясь к источникам витаминов, можно сказать, что приоритет в этом случае остается за растениями. Не секрет, что на содержание витаминов в пищевых продуктах существенно влияет тот или иной сезон календарного года и кулинарная обработка, что опять нас возвращает к вопросу организации рационального и сбалансированного питания.

Таблица 1

Классификация витаминов

Научные исследования последних лет показали не только высокую биологическую активность витаминов, но и то, что, как правило, этой активностью обладают не сами витамины, а их производные — коферменты, которые нашли широкое применение в медицинской практике.

Если говорить о производстве основной части витаминной продукции, то ведущее положение здесь занимают химические методы, но в ряде производств в качестве их полноправного конкурента как в нашей стране, так и за рубежом, выступают биотехнологические методы, использование которых более предпочтительно в связи с ужесточением экологических требований к фармацевтическому производству. Кроме того, при применении биотехнологических методов появляются возможности сокращения части стадий химического синтеза за счет использования высокоактивных штаммов микроорганизмовпродуцентов. Например, производство витаминов В₁₂, В₂, В₃ и D (эргостерина) осуществляется в одну стадию. Также микроорганизмы нашли свое применение и в синтезе витамина С, убихинонов, каротиноидов.

Витамин В₁₂ (кобаламин)

В₁ настоящее время витамин В₁₂ получают чисто биотехнологическими методами. Витамин Выявляется производным внутреннего кобальтового комплекса нуклеотида бензимидазола и макроциклической корриновой системы. Способность синтезировать соединения корриноидной природы широко распространена среди прокариотических микроорганизмов. Так, некоторые мутантные штаммы пропионовых бактерий из рода Propionibacterium способны продуцировать свыше 50 мг витамина В₁₂ на 1 л среды, а в присутствии его предшественника 5,6-диметилбензимидазола (5,6-ДМБ) накапливать до 200 мг на 1л культуральной жидкости. Культивируют продуценты витамина В₁₂ на средах, приготовленных из пищевого сырья (кукурузный и мясной экстракты, соевая и рыбная мука). В настоящее время успешно ведется поиск активных продуцентов, образующих достаточное количество витамина на средах, из непищевого сырья, когда в качестве источника углерода и энергии используются изопропиловый спирт, метанол и др. Пропионовые бактерии выращивают периодическим методом в анаэробных условиях на среде, содержащей кроме пищевого сырья глюкозу, соли кобальта и сульфат аммония.

В процессе ферментации образуются кислоты, которые затем нейтрализуют, непрерывно подавая в ферментер раствор щелочи. Через 72 ч после начала ферментации в питательную среду вносят предшественник (5,6-ДМБ), так как без добавления последнего вместо витамина В₁₂ синтезируются фактор В (кобинамид) и не обладающий терапевтическим эффектом псевдовитамин В₁₂, у которого азотистым основанием служит аденин. Общее время ферментации — 6 сут. По ее окончании витамин В₁₂ остается в клетках бактерий, т.е. в биомассе, которую далее сепарируют, а целевой продукт экстрагируют подкисленной водой.

Необходимо отметить, что в качестве новых перспективных разработок создан высокопродуктивный штамм Propionibacterium ari, способный в отличие от ранее известных продуцентов выделять витамин В₁₂ в культуральную среду. Для предотвращения образования коферментной формы витамина В₁₂ в качестве стабилизатора добавляют нитрит натрия. Далее следуют стандартные стадии выделения и очистки, поэтому подробно на них останавливаться не будем. Полученный продукт используется для изготовления разных лекарственных форм препарата и в производстве поливитаминных препаратов.

Витамин В₂ (рибофлавин)

Биосинтез флавинов осуществляется как растительными, так и многими бактериальными клетками, а также плесневыми грибами и дрожжами. Благодаря именно микробному биосинтезу рибофлавина в желудочно-кишечном тракте жвачные животные не нуждаются в этом витамине. У человека синтезирующихся флавинов недостаточно для предупреждения гиповитаминоза.

Витамин В₂ хорошо растворим в воде, устойчив в кислой среде, но легко разрушается в нейтральной и щелочной средах, а также под действием УФ-облучения. Для этого витамина характерно функционирование в коэнзимных формах: флавиномононуклеотид (ФМН) и флавиноадениндинуклеотид (ФАД). Именно на примере выделения рибофлавина в культуральную жидкость было открыто явление сверхсинтеза. При промышленном получении рибофлавина используют культуры дрожже подобных грибов Eremothecium ashbyii и Ashbya gossipii, синтезирующих до 3,8 и 6,4 т/л рибофлавина соответственно. Однако серьезным недостатком этих культур является их нестабильность при хранении на твердых средах во всем диапазоне температур — от комнатной до температуры лиофилизации, в результате чего они теряют способность к сверхсинтезу рибофлавина. Поэтому для сохранения активности штамма приходится систематически проводить рассев на твердые среды, отбирая колонии с высокой активностью.

Сейчас вместе с вышеуказанными культурами при промышленном получении рибофлавина в помощью методов используется мутантный штамм продуцент Bacillus subtilis с нарушенной регуляцией синтеза витамина В₂. Этот штамм устойчив к наиболее сильному антиметаболиту рибофлавина — его аминоаналогу розеофлавину и обладает способностью к сверхсинтезу витамина В₂. При культивировании его на среде с мелассой и дрожжевым экстрактом в культуральной жидкости накапливается 3,5—4,5 г/л рибофлавина. При этом время ферментации сократилось в 3 раза. Рибофлавин получают и химическим методом, используя в качестве биокатализатора сухие клетки бревибактерий. Причем, если биосинтез с нативными клетками занимает несколько суток, то при биосинтезе с суспензией сухих клеток время синтеза ФАД составляет всего 15 — 17 ч.

Витамин В₃ (лантотеновая кислота)

В основном в условиях промышленного производства пантотеновую кислоту получают методом химического синтеза. Наиболее важной коферментной формой витамина В₃ является кофермент ацетилирования (КоА). Способностью продуцировать в значительных количествах КоА обладают многие микроорганизмы, в частности актиномицеты. Активно внедряются в промышленное производство способы получения пантотеновой кислоты и ее структурных компонентов из ß-аланина и пантотеата калия с помощью иммобилизованных клеток бактерий, а также достигнуты существенные успехи при получении КоА с использованием мутантных штаммов Brevibacterium ammoniagenes, которые позволяют получать КоА в количестве до 3 г на литр.

Витамин РР (никотиновая кислота)

Одним из наиболее распространеных биотехнологических способов получения коферментной формы никотиновой кислоты — никотинамидадениндинуклеотида (НАД) является выделение (экстракция) его из микроорганизмов, как правило, из пекарских дрожжей. Для повышения содержания НАД в дрожжевых клетках культивирование проводят на средах с предшественниками синтеза никотиновой кислоты. Так, при добавлении в среды культивирования аденина или самой никотиновой кислоты получают до 12 мг НАД на І г клеток (по сухой массе). Использование мутантных штаммов Brevibacterium ammoniagenes с одновременным изменением проницаемости мембраны клеток микроорганизмов (коферменты через биомембраны не проникают) с помощью поверхностно-активных соединений (цетилсульфата натрия, цетилпиридина хлорида) позволяет получать НАД до 6 г/л.

Аскорбиновая кислота (витамин С)

Аскорбиновая кислота в мировом промышленном производстве витаминной продукции в целом занимает наибольшую долю — около 40 тыс. т в год. Ее синтез был разработан швейцарскими учеными А. Грюсснером и С. Рейхштейном в 1934 г. и используется до настоящего времени. Синтез аскорбиновой кислоты является многостадийным химическим процессом, в котором только одна стадия представлена биотрансформацией. Эта стадия трансформации d-сорбита в L-сорбозу при участии ацетатных бактерий. Для получения сорбозы используют глубинную ферментацию, когда культуру продуцента Gluconobacter oxydans выращивают в ферментерах периодического режима с мешалкой и барботером для усиления аэрации и массообмена в течение 20 — 40 ч с результатом по выходу сорбозы до 98% исходного количества сорбита в среде. Обычно для достижения такого высокого выхода целевого продукта в питательную среду вносят кукурузный или дрожжевой экстракт в количестве около 20%. По окончании ферментации сорбозу выделяют из культуральной жидкости. Помимо оптимизации среды можно совершенствовать и технологическую аппаратуру. Например, переход от периодического культивирования продуцента Gluconobacter oxydans к непрерывному в аппарате колоночного типа увеличивает скорость образования сорбозы в 1,7 раз.

В настоящее время широкое использование биотехнологических процессов позволяет совершенствовать синтез аскорбиновой кислоты, сокращая многоэтапные и дорогие химические стадии. Например, синтез витамина С осуществляют енолизацией его важнейшего промежуточного продукта — 2-кето-L-гулоновой кислоты, которую, в свою очередь, получают методом двухстадийного микробиологического синтеза, состоящего из окисления d-глюкозы в 2,5-дикето-d-глюконовую кислоту (2,5-ДКДГК) и биотрансформации последней в 2-кето-L-гулоновую кислоту (2-КГК).

Основными продуктивными микроорганизмами, обеспечивающими процессы окисления d-глюкозы в 2,5-ДКДГК и восстановление последней до 2-КГК, являются мутантные штаммы Erwinia punctata и Corynebacterium sp., при использовании которых выход целевого продукта составляет около 90 % количества глюкозы.

Однако данная технология имеет существенные недостатки, так как при совместном культивировании продуцентов происходит ингибирование синтеза 2-КГК. Поэтому культуральную жидкость после выращивания продуцента 2,5-ДКДГК стерилизуют, применяя поверхностно-активные вещества (ПАВ), что позволяет значительно сократить потери при получении гулоновой кислоты.

Существует и другой биотехнологический способ получения гулоновой кислоты, основанный на синтезе этого продукта штаммом микроорганизмов рода Gluconobacter из сорбозы, производство которой имеет высокую рентабельность. Способность к синтезу целевого продукта обусловлено наличием у этого микроорганизма видоспецифических дегидрогеназ.

Витамин D (кальциферол)

Впервые кальциферол был выделен из рыбьего жира в 1936 г. А. Виндаусом и применен при лечении рахита. Он получил название витамина D₃, так как ранее из растительных масел был выделен эргостерин под названием витамин D₁, при облучении которого получили витамин D₂ — эргокальциферол (кальциферол — в переводе «несущий кальций»),

В настоящее время кальциферол производят из эргостерина с применением УФ-облучения биотехнологическим методом. В процессе преобразования эргостерина в эргокальциферол принимают участие микроорганизмы. Особенно богаты эргостерином клетки дрожжей всех видов и плесневые грибы. В сухой биомассе дрожжей содержится 5—10% эргостерина.

В качестве промышленного источника эргостерина используют дрожжи Saccharomyces cerevisiae вследствие высокого содержания в них эргостерина. В анаэробных условиях культивирования происходит накопление в клетках дрожжей сквалена (предшественника эргостерина). Индукция синтеза эргостерина начинается при строго определенной концентрации кислорода от 0,03 до 2 %. При этом среда должна содержать избыток углеводов и малое количество азота. По окончании процесса спиртового брожения дрожжи отделяют от барды и вносят в питательную среду необходимое количество источников углерода, азота и фосфора. Ферментацию ведут в аэробных условиях 12 —20 ч, по окончании которой клетки дрожжей отделяют от культуральной жидкости, добавляют антиоксиданты и сушат. Обычно в такой биомассе содержание эргостерина достигает 1,5 %.

При дальнейшем УФ-облучении эргостерина получают витамин D₂, который либо используется как пищевая добавка, либо подвергается дальнейшей обработке с целью получения кристаллического витамина D₂.

При получении эргостерина из дрожжеподобных грибов рода Candida сухую массу грибов экстрагируют петролейным эфиром для извлечения остаточных углеводородов. Полученная таким образом липидная фракция называется «микробный жир» и является побочным продуктом микробиологической промышленности. Эта фракция может быть использована как источник не только эргостерина, но и убихинона, а также других жирорастворимых соединений. Для грибов рода Candida характерно, что при переходе от периодического культивирования на углеводородах к непрерывному в клетках сохраняются как уровень образования стеринов, так и относительное содержание в них эргостерина.

Витамин А (ретинол)

Витамин А — циклический, непредельный одноатомный спирт, образуемый в слизистой кишечника и печени из провитаминов: a-, ß- и у-каротинов (наибольшей активностью обладает ß-каротин, так как образует две молекулы ретинола; другие — только одну) под воздействием фермента каротиноксидазы. Каротиноиды — широко распространенная группа природных пигментов, образуемых высшими растениями, водорослями и некоторыми микроорганизмами. У животных эти пигменты не образуются, а поступают с продуктами питания и служат источником витамина А.

Получение ß-каротина осуществляется химическим и микробиологическим (с использованием штаммов мицелиальных грибов Blakslea trispora) методами. В настоящее время химический синтез ß-каротина более рентабелен. Микробиологический метод получения ß-каротина многостадиен и требует использования достаточно сложной по составу и дорогой кукурузно-соевой среды с растительными маслами, ПАВ и специальными стимуляторами. Разнополые штаммы выращивают сначала отдельно, затем — совместно в ферментере в течение 6 — 7 сут при интенсивной аэрации и 26 ◦С. Если из измельченного мицелия экстрагировать ß-каротин подсолнечным маслом, то можно использовать его в виде масляных растворов. Применяя экстракцию органическим растворителем с последующей кристаллизацией, получают ß-каротин в кристаллическом виде.

Использование отходов крахмало-паточного производства — кукурузного экстракта и зеленой патоки позволяет снизить себестоимость получаемой продукции, а применение в качестве источника углерода целлобиозы, образующейся при утилизации отходов целлюлозы, позволяет в несколько раз увеличить синтез каротиноидов у штаммов культуры Blakslea trispora.

Убихиноны (коферменты Q)

Убихиноны в последнее время вызывают интерес как перспективные лечебные препараты. С одной стороны, они синтезируются в организме животных и человека, делая необязательным их поступление с пищевыми продуктами, что отличает их от группы витаминов.

С другой стороны, недостаток убихинонов ведет к нарушениям в обменных процессах, характерных для проявлений недостаточности витаминов групп В и К. Убихиноны являются регуляторами тканевого дыхания, окислительного фосфолирирования в цепи транспорта электронов и за счет высокой специфичности проявляют свой регуляторный эффект.

С практической стороны наибольший интерес вызывают высшие гомологи: убихинон-9 (KoQ₉) и убихинон-10 (KoQ₁₀). Убихинон-10 является коферментом организма человека, вследствие чего на его основе создан лекарственный препарат Ubichynon compositum, проявляющий общетонизирующее, антиоксидантное и иммуностимулирующее действие.

В производстве убихинонов применяются биотехнологические методы, в основе которых лежит экстракция KoQ из биологического материала. В промышленном производстве убихинонов в качестве субстрата используются как растительные ткани (каллус риса или опухолевые ткани Carthamus tinctorius), так и микроорганизмы с высоким содержанием убихинонов, например дрожжи Cryptococcus curvatus и грибы Candida maltosa.

В настоящее время используется биотехнология получения убихинона-9 и эргостерина из микробных липидов, являющихся побочным продуктом крупного производства белково-витаминного концентрата при выращивании грибов Candida maltosa.

Установлено, что биомасса уксуснокислых бактерий (Gluconobacter oxydans), которые используются в производстве аскорбиновой кислоты на этапе окисления d-сорбита в L-сорбозу, содержит значительное количество KoQ₁₀ без примеси его гомологов. Причем, с одной стороны, эта биомасса является отходом производства аскорбиновой кислоты, с другой стороны, штаммы Gluconobacter oxydans в биомассе характеризуются наибольшей окислительной активностью по сорбиту. Этот уникальный факт позволил разработать и внедрить совместную технологию получения L-сорбозы и экстракции убихинона-10 из отсепарированной биомассы с последующей очисткой и с выходом целевого продукта до 85 %.