Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Разделение смесей белков и пептидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Введение

М. Д. УОТЕРФИЛД (М. D. WATERFIELD, Pro- tein Chemistry Laboratory, Imperial Cancer Research Fund, Lincoln's Inn Fields, London WC23A 3PX,

ил)

Появление новой аппаратуры для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) значительно расширило возможности очистки белков и пептидов с целью их последующего функционального и структурного изучения. Используемые в настоящее время сорбенты позволяют проводить разделение чаще всего по одному из следующих признаков: размеры молекул, заряд, гидрофобность.

Фракционирование по размеру разделяемых молекул (гель-хроматография) происходит при перемещении по колонке в потоке элюента смеси веществ разного молекулярного веса; при этом внутренний объем пор частиц сорбента доступен лишь молекулам, имеющим размеры, не превышающие диаметр пор. Эти молекулы участвуют в процессе распределения вещества между подвижной и неподвижной фазами системы. В отличие от них молекулы, не проникающие внутрь гранул сорбента, слабо участвуют в процессах распределения и элюируются быстрее малых молекул.

В адсорбционной хроматографии результат разделения определяется процессами сорбции — десорбции молекул на поверхности носителя. Сорбция обусловлена совокупностью взаимодействий молекул разделяемых веществ и растворителей с поверхностью сорбента (дипольные взаимодействия, водородные связи, вандерваальсовы силы, ионные взаимодействия). В ходе разделения молекулы растворенного вещества и растворителя конкурируют с участками связывания на поверхности адсорбента. Степень сорбции вещества можно регулировать, меняя либо характеристики распределяемого вещества (например, заряд присутствующих в растворе частиц), либо свойства элюента. В результате этих изменений происходит конкурентное образование (или разрушение) множественных контактов между растворенным веществом, растворителем и сорбентом.

Силы гидрофобного взаимодействия проявляются в распределительной обращенно-фазовой (ОФ) хроматографии, проводимой на носителях с химически привитыми гидрофобными остатками С₈, С₁₈.

Реальные хроматографические процессы проходят по смешанным механизмам. Например, современные колонки для гель-хроматографии заполнены отнюдь не инертным сорбентом и разделение в них происходит не только по размеру молекул, но включает и адсорбцию, и распределение.

Благодаря появлению ОФ-хроматографии стало возможным проводить разделения веществ быстро и с высокой эффективностью. В последнее время в литературе часто описываются методики ОФ-разделения больших пептидов. Очевидно, дальнейшие достижения в этом направлении зависят от успехов в разработке новых носителей.

Для препаративной и даже для промышленной ВЭЖХ пептидов имеется коммерческое оборудование. Появились также высокочувствительные микроколоночные системы, предназначенные для анализа следовых количеств вещества. Большинство современных приборов не рассчитано на работу при малых скоростях потока, необходимых при разделениях на микроколонках. Однако нет сомнения в том, что вскоре появятся методы разделения пикомольных количеств пептидов и белков.

Информативность анализа резко повышается при использовании детекторов, имеющих диодную линейку. Эти детекторы способны быстро (до 10 раз/с) сканировать спектры компонентов, элюируемых с колонки; включение в установку также мини- или микрокомпьютеров нового поколения позволяет контролировать чистоту разделяемых веществ и проводить селективное определение пептидов и белков, обладающих уникальными характеристиками поглощения.

Кроме того, можно ожидать, что в недалеком будущем будут созданы комплексы, включающие масс-спектрометр и микроколоночный хроматограф, что позволит не только обнаруживать небольшие пептиды, но и определять их структуру.