Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Определение состава белковых олигомеров. Получение мономеров и полипептидных цепей
Методы идентификации олигомеров
Методы определения молекулярной массы мономеров
Стехиометрическое соотношение мономеров в олигомере
Определение состава олигомера по молекулярным массам мономеров
Сшивание субъединиц бифункциональными реагентами
Электрофорез в полиакриламидном геле
Сшивание олигомера и мономера
Другие типы поперечных связей в белках
Получение мономеров с целью секвенирования
Гидролиз N-концевой пироглутаминовой кислоты
Восстановление сульфоксидов N-метилмеркаптоацетамидом
Техника работы с липопротеинами
Отщепление олигосахаридных фрагментов гликопротеинов
Фрагментация полипептидов химическими методами
Расщепление дисульфидных связей
Восстановление и S-карбоксиметилирование
Другие защитные группы (по SH-гpyппe)
Расщепление S-S-групп путем окисления
Расщепление по остатку метионина
Расщепление по остатку триптофана
Расщепление с помощью BNPS-скатола
Расщепление по остатку триптофана в системе ДМСО - галогеноводородные кислоты
Расщепление по остатку триптофана бромоцианом в гептафторомасляной кислоте
Расщепление по остатку триптофана о-иодозобензойной кислотой
Расщепление по остатку тирозина
Расщепление по остатку цистеина
Цианирование с помощью 2-нитро-5-тиоцианобензойной кислоты
Другие методы химического расщепления пептидных связей
Расщепление по остатку пролина
Расщепление по остатку гистидина
Расщепление по остатку дегидроаланина
Другие методы расщепления пептидных связей
Фрагментация полипептидной цепи ферментативными методами
Общие условия ферментативного гидролиза
Продолжительность ферментативного гидролиза
Контроль за процессом ферментативного гидролиза
Завершение ферментативной реакции
Методы модификации белков
Расщепление дисульфидных связей
Алкилирование сульфгидрильных групп
Модификация карбоксильных групп белка
Протеазы с высокой специфичностью
Протеаза V8 из Staphylococcus aureus
Протеазы с низкой специфичностью
а-Литическая протеаза из Sorangim sp.
Дисульфидные связи
Определение числа дисульфидных связей
Расщепление полипептидной цепи до коротких цистинсодержащих пептидов
Гидролиз трипсином и химотрипсином
Гидролиз стафилококковой протеазой
Гидролиз после малеилирования и сукцинилирования
Фракционирование цистинсодержащих пептидов
Обнаружение цистинсодержащих пептидов
Идентификация и локализация цистинсодержащих пептидов
Расщепление дисульфидных связей
Идентификация по известной аминокислотной последовательности
Идентификация дисульфидных связей у белков с неизвестной аминокислотной последовательностью
Специальные методы
Специфическое расщепление по остаткам цистеина
Аффинная хроматография белков
Область применения аффинной хроматографии
Методы приготовления аффинного сорбента
Общие приемы аффинной хроматографии
Иммобилизованные субстраты, ингибиторы и кофакторы ферментов
Примеры
Стратегия очистки редких белков
Разделение смесей белков и пептидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Гель-хроматография
Определение истинных молекулярных масс
Адсорбция и распределение полипептидов и белков
Подготовка к нанесению образца
Выбор колонки для обращенно-фазового разделения
Обращенно-фазовое разделение пептидов
Выделение пептидов с использованием фосфорной кислоты
Разделение пептидов с использованием трифтороуксусной и гептафторомасляной кислот
Корреляция между удерживанием и структурой
Скоростная жидкостная хроматография белков
Пептидное картирование белков
Пептидное картирование - типы анализируемых структур
Картирование пептидов на практике
Двумерное картирование пептидов
Пептидное картирование с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии
Аналитические методы
Концентрирование растворов белков
Исчерпывающий гидролиз белков для аминокислотного анализа
Триптофан
Определение триптофана после щелочного гидролиза белка
Определение триптофана после кислотного гидролиза белка
Определение триптофана в интактном белке
Остатки амидов дикарбоновых аминокислот
Серусодержащие аминокислоты
Аргинин
Фосфорилированные аминокислоты
y-Карбоксиглутаминовая кислота
Ацетильная и формильная группы
Определение ацетильных и формильных групп
Обнаружение соединений при хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента
Флуоресцентные методы обнаружения
Обнаружение с помощью нингидрина
Тонкослойная хроматография аминокислот
Колоночная хроматография аминокислот
Газожидкостная хроматография аминокислот
Общая методика приготовления образцов
Количественное определение белка
Определение белка с помощью реактива Фолина - Чикольте
Определение белка с помощью биуретовой реакции
Определение белка с помощью кумасси бриллиантового голубого
Определение белка с помощью сульфобромофталенина
Определение белка с тринитробензолсульфокислотой в присутствии липидов
Метод атомно-абсорбционной спектрофотометрии
Методы окрашивания белков в гелях
Методы окрашивания белков красителями
Окрашивание белков комплексами серебра
Окрашивание белков на нитроцеллюлозной бумаге
Окрашивание с помощью индийских чернил
Обнаружение с помощью комплекса серебра и антител
Определение белка, присоединенного к твердому носителю
Определение аминогрупп на твердом носителе
Определение аминогрупп на гидрофильных матрицах
Определение аминогрупп реакцией с хлоранилом
Определение природы заместителя на смоле по окрашиванию
Колориметрическое определение карбодиимидов
Флуорометрическое определение карбодиимида
Углеводсодержащие белки
Метилгликозид-триметилсилильный метод
Чувствительный метилгликозид-триметилсилильный метод
Метод газовой хроматографии - масс-спектрометрии
Определение нейтральных сахаров и аминосахаров в виде альдитацетатов методом ГЖХ
Определение альдитов тонкослойной и газожидкостной хроматографией
Определение нейтральных сахаров и аминосахаров на аминокислотном анализаторе
Энантиомерный анализ смеси аминокислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Реагенты
Синтез N, N-ди-н-пропил-L-аланина
Традиционная стратегия определения структуры белков
Фракционирование растворимых пептидов
Хроматография на колонке с дауэксом-50
Хроматография на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой
Высоковольтный электрофорез и хроматография на бумаге
Фракционирование нерастворимых пептидов
Контроль гомогенности и определение аминокислотной последовательности пептидов
Реконструкция полипептидной цепи
Методики
Препаративные электрофорез и хроматография на бумаге
Определение аминокислотной последовательности пептидов по методу Эдмана с идентификацией дансиламинокислот
Конденсация и расщепление по Эдману
Деградация по Эдману. Методика
Методы твердофазного анализа аминокислотной последовательности
Материалы
Стеклянные шарики для разбавления навески полимеров
Растворы реагентов и буферов для секвенатора
Синтез смол
Определение содержания аминогрупп в носителях на основе органических полимеров или пористых стекол
Методы присоединения
Присоединение лизилсодержащих пептидов с помощью ДИТЦ
ДИТЦ-метод с использованием изотиоцианатного стекла
Присоединение по лактону гомосерина
Присоединение по карбоксилу при помощи карбодиимида
Контроль степени присоединения
Отщепление на твердофазном секвенаторе
Перегруппировка анилинотиазолинона в ФТГ
Обсуждение
Твердофазный анализ небольших пептидов
Твердофазный анализ крупных пептидов и белков
Сравнение жидкофазного и твердофазного методов
Анализ структуры на микроуровне
Анализ фенилтиогидантоинов аминокислот
Аналитические методы
Высокоэффективная жидкостная хроматография
Обратный гидролиз ФТГ-производных аминокислот
Определение аминокислотной последовательности с использованием 4-диметиламиноазобензол-4'-изоцианата (в ручном варианте)
ДАБИТЦ - ФИТЦ-методика в жидкофазном варианте
ДАБИТЦ - ФИТЦ-методика в твердофазном варианте
Превращение тиазолинонов аминокислот в тиогидантоины
Идентификация ДАБТГ-аминокислот
Высокоэффективная жидкостная хроматография
Современное состояние автоматического жидкофазного анализа аминокислотной последовательности
Сравнение квадрола с летучими буферами
Основные проблемы, возникающие при использовании автоматического секвенатора
Утечки в вакуумной линии в системе с одним насосом
Контроль качества работы прибора
Новейшие методы твердофазного и жидкофазного определения аминокислотной последовательности
Твердофазный анализ. Новейшие подходы
Присоединение пептидов к носителям и «забивка» оставшихся реакционных центров носителя
Другие методы последовательного отщепления
Автоматический жидкофазный анализ. Усовершенствованные методики
Анализ белков и больших пептидов на обычном уровне
Анализ последовательности аминокислот небольших и гидрофобных пептидов
Анализ аминокислотной последовательности на микроуровне с использованием газофазного пептидо-белкового секвенатора
Очистка полипептида для микроанализа
Обсуждение
Иммобилизация образца и чувствительность прибора
Количество анализируемого образца
Определение С-концевой последовательности аминокислот
Выделение и идентификация С-концевых пептидов
Методики ионообменной хроматографии
Двумерное пептидное картирование
Определение С-концевых групп
Определение С-концевых аминокислот в виде альдегидов
Определение С-концевых аминокислот путем алкоголиза оксазолов
Определение С-концевой последовательности
Расщепление при помощи тиоцианата
Расщепление при помощи цианамида
Другие химические методы расщепление
Применение масс-спектрометрии электронного удара для определения аминокислотной последовательности пептидов и белков
Требования к анализируемым пептидам
Требования к аналитическим приборам
Интерпретация масс-спектров
Особые случаи применения метода
Пептиды с защищенной N-концевой аминогруппой
Определение N-концевой аминокислотной последовательности
Белки, содержащие остатки у-карбоксиглутаминовой кислоты
Рентгеновская кристаллография и электронная микроскопия
Дифракция рентгеновских лучей
Получение изображений молекул - разновидность структурного анализа
Дифракция рентгеновских лучей
Получение изображений молекул - разновидность структурного анализа
Принципы определения структуры в рентгеноструктурном анализе
Конструирование моделей с помощью средств компьютерной графики
Электронная микроскопия
Разрешение и ограничения метода
Подготовка образцов и их «окрашивание»
Трехмерная электронная микроскопия
Предсказание конформации пептидов и белков
Недостатки традиционных методов
Арсенал современных теоретических методов
Периодическое оценивание и картирование
Предсказание вторичной структуры. Специальный тип расчетов
Проверка потенциальных функций, полученных из структурных данных, с помощью более точных методов
Попытки предсказания третичной структуры глобулярных белков