Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Новейшие методы твердофазного и жидкофазного определения аминокислотной последовательности
Автоматический жидкофазный анализ. Усовершенствованные методики
Анализ белков и больших пептидов на обычном уровне

Два главных препятствия до сих пор ограничивают пределы возможностей автоматического ЖФ-метода Эдмана [32]. Первой проблемой является перенос остаточных аминокислот на каждый последующий цикл. Это явление происходит как из- за неполного присоединения реагента к белку, так и из-за неполного отщепления модифицированной N-концевой аминокислоты в виде 2-анилинотиазолинона; другая проблема заключается в том, что па стадии кислотной обработки карбамоилпептида (белка) происходит расщепление внутренних неустойчивых пептидных связей, приводящее к появлению новых полипептидных цепей, т. е. новых последовательностей. В результате этих двух процессов накопление фона ФТГ-аминокислот достигает такого уровня, что однозначная идентификация последовательности аминокислот основной цепи становится невозможной. Для снижения уровня остаточных пиков было предложено проводить и конденсацию, и отщепление АТЗ дважды в каждом цикле [31]. Однако такое изменение стандартной методики приводит к большим потерям пептида (вымывание из реактора). Для снижения этих потерь в реактор добавляют носители — белки или органические полимеры [78, 92], но, к сожалению, белки подвержены ацидолизу, в результате чего возникают ложные последовательности. Для снижения уровня остаточных аминокислот, появляющихся в результате неполного взаимодействия ФИТЦ с полипептидами (особенно если Pro—N-концевой остаток), повышают температуру реактора до 55 °С [94].

Предполагалось, что изменение порядка добавления ФИТЦ и буфера в реактор снизит степень расщепления внутренних пептидных связей [102], так как расщепление связей происходит предположительно в основном из-за N→O-ацильной миграции, в ходе которой гидроксильные группы Ser атакуют пептидные связи, образуемые аминогруппами Ser. Миграция обратима в щелочных условиях, поэтому в отсутствие ФИТЦ конкурирующее тиокарбамоилирование исключается. Это изменение методики не дало ожидаемого эффекта, так как ФИТЦ и гептан не смешиваются с квадрольным буфером. Другой способ снижения уровня расщепления внутренних пептидных связей заключается в регулировании содержания воды в гептафторомасляной кислоте, используемой для отщепления. Высокое содержание воды способствует гидролизу пептидных связей; в то же время при низком содержании воды в кислоте (—0,01%) уровень расщепления снижается [11]. Сочетание этого подхода с использованием различных буферов на стадии карбамоилирования (например, N,N,N',N'-тетракис(2-гидроксиэтил)этилендиамин вместо квадрола) позволяет проводить автоматический анализ с постадийным выходом, превышающим 98% [10].

Значительное увеличение возможностей прибора (анализ последовательности 60—70 аминокислот) было достигнуто за счет модификации стандартного прибора (большой объем реактора, увеличение скорости вращения реактора до 1800— 3600 об/мин, охлаждаемая ловушка, соединенная с высоковакуумным насосом) [34].