Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Современное состояние автоматического жидкофазного анализа аминокислотной последовательности
Подготовка образца

Невозможно обсуждать размер навески и степень пригодности образца для проведения анализа, не упоминая об особенностях и возможностях самого прибора, выбранной программы анализа, вспомогательного оборудования, потому что направление обсуждения во многом диктуется тем, применяется ли 1 М или 0,1 М раствор квадрола [3], используется ли полибрен совместно с охлаждаемой ловушкой или без нее. В большинстве случаев в зависимости от этих различий рабочие параметры анализа могут измениться почти на порядок (но не более). Кроме того, на результат определения влияет природа буфера (квадрол или N,N-диметилаллиламин, или сокращенно ДМАА).

13 лет назад, когда наша лаборатория занималась определением аминокислотной последовательности тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, для установления последовательности из 30—40 аминокислот обычно требовалось 10—20 мг образца. В настоящее время, применяя модифицированный прибор, 0,1 М квадрол, полибрен, охлаждаемую ловушку, мы регулярно проводим определение 60—80 остатков, загружая в прибор 1—2 мг образца (двукратное увеличение эффективности отщепления). Трудно точно указать причины такого улучшения результатов — вероятнее всего, проявляется взаимное влияние многих факторов.

Обычно мы готовим образцы к анализу на секвенаторе лиофилизацией их из воды, разбавленных растворов кислоты, летучих водных буферов. Образцы хранятся в закрытых сцинтилляционных баночках в виде белого пушистого порошка. В нашей практике бывали случаи, когда образцы, не имевшие такого внешнего вида, не удавалось анализировать. Причины подобных неудач не ясны, но, возможно, они связаны с нерастворимостью образца и наличием в нем примесей. Из-за трудностей идентификации остатков цистеина большинством обычных методов определения ФТГ-производных аминокислот почти всегда перед анализом последовательности мы восстанавливаем и карбоксиметилируем наши образцы радиоактивными реагентами. Поэтому небольшая аликвота каждого определяемого ФТГ-производного проверяется на наличие радиоактивности.

Образцы, содержащие соли, нельзя наносить в реактор секвенатора, так как это может привести к вымыванию всего образца. Это легко прослеживается при анализе радиоактивно меченных препаратов — в продуктах первых двух-трех циклов отщепления радиоактивность постоянно и сильно уменьшается, достигая в конце концов уровня фона. Поэтому следует избегать присутствия солей в реакторе секвенатора. В последние годы часто наносят образцы в присутствии ДСН. Хотя этот прием не получил очень широкого распространения в нашей лаборатории, наличие до 1% ДСН оказывается обычно полезным для растворения образцов, в особенности мембранных белков, выделенных из ДСН-гелей, без ущерба для последующего определения структуры белка.

В выборе наилучшего растворителя для нанесения образца в реактор нет единодушного мнения, и используемые системы растворителей меняются от лаборатории к лаборатории. По-видимому, этот вопрос никем не изучался систематически. Мы растворяем образцы в 25%-ной уксусной кислоте. Если они при этом не растворяются, то их нагревают до 80 °С в течение 10—30 мин с одновременным тщательным перемешиванием на вибромешалке. Если и такая обработка не помогает, то образец немедленно лиофилизируется и сохраняется в таком состоянии в течение 24 ч. На следующий день можно использовать два разных варианта растворения. Во-первых, можно попробовать растворить его в 1 М аммиаке. Многие белки растворяются при повышении pH среды, поэтому переход к 1 М аммиаку позволяет перевести в раствор около половины белков, не растворимых в 25%-ной уксусной кислоте. Если белок не растворяется в аммиаке, обычно он вновь лиофилизируется, а нанесение в секвенатор задерживается еще на 24 ч. Второй вариант, часто используемый в нашей лаборатории, заключается в растворении образца в концентрированной летучей органической кислоте (муравьиная или гептафторомасляная). Во многих лабораториях гептафторомасляную кислоту (ГФМК) регулярно используют для этой цели. Мы не применяем ее для растворения образцов из-за трудностей обращения с ГМФК, а также ее хранения и использования в качестве растворителя общего назначения. Однако можно применять кислоту, заливаемую в секвенатор, и тем самым исключить некоторые осложнения, связанные с хранением этого опасного реактива.

Белки, заведомо имеющие неблокированную N-концевую аминокислоту, но не поддающиеся анализу на секвенаторе, ведут себя так по разным причинам. Если в ходе восстановления и алкилирования (в гидрохлориде гуанидина или в мочевине) не было тщательного контроля pH (>7,0) и концентрации алкилирующего агента, то существует определенная вероятность реакции этого агента с N-концевой аминокислотой. Если это происходит, то белок оказывается «блокированным». Эта частная проблема становится бедствием, ибо не существует удобного способа удаления алкилирующей группы. Второе затруднение возникает, если белок нерастворим в одном или нескольких реагентах (растворителях). Мы обнаружили, что чаще всего это относится к квадрольному буферу. Часто, когда в присутствии квадрола было невозможно провести анализ, замена его на ДМАА-буфер позволяла получить отличные результаты.

После нанесения каждого образца, по до начала каждого анализа па приборе надо выполнить несколько операций. В нашей лаборатории проводят две таких операции. Первая — «высушивание образца» — заключается в попеременной продувке реактора аргоном и вакуумировании. Такая подготовка позволяет получить на стенке реактора тонкую, равномерно распределенную сухую пленку образца. Эта операция автоматически проводится перед началом каждого анализа, но затем автоматически же исключается из общей программы анализа. После этого обычно проводится другая подготовительная операция — один полный цикл отщепления при отключенной подаче ФИТЦ в реактор (клапан подачи этого реагента R₁ в положении «off»). Это задерживает весь процесс определения не более чем на 10 мин после сушки образца, потому что сразу же после выполнения по программе команды «добавление R₁» можно включить клапан «добавление R₁» и далее весь процесс продолжается автоматически по полной обычной программе.

Программирование при помощи микропроцессора позволяет упростить выполнение этих операций. Мотивы для указанного «высушивания — вакуумирования» очевидны. Перед добавлением ФИТЦ и квадрола важно тщательно высушить образец и равномерно распределить его по поверхности реактора. Обычно образцы анализируются без добавления ФИТЦ в первом цикле отщепления для удаления (промывками) всех посторонних примесей, ясно детектируемых ВЭЖХ. Такая предварительная обработка образца служит дополнительным средством стандартизации условий нанесения образца в реактор и подготовки его к анализу.