Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аффинная хроматография белков
Общие приемы аффинной хроматографии
Иммобилизованные антитела

Так называемый принцип «иммуноадсорбции» был применен в одной из первых работ по аффинной хроматографии. Сначала очищенный антиген, использованный для иммунизации, присоединяют к нерастворимому носителю, а затем осуществляют сорбцию специфических антител, содержащихся в сыворотке, на полученном аффинном сорбенте. Десорбцию проводят концентрированным раствором антигена или его фрагментов (гаптенов). В случае отсутствия последних в достаточном количестве для элюирования используют буферные растворы с низким pH, а также растворы, содержащие гуанидин-HCl или мочевину. Такой вариант иммуноаффинной хроматографии приводит к получению гетерогенной популяции антител или лимфоцитов, содержащих антитела. При этом для приготовления иммуносорбента и для элюирования требуется значительное количество очищенного антигена.

В том случае, когда количество исследуемого антигена достаточно только для первоначальной иммунизации, используют другой вариант иммуноаффинной хроматографии, разработанный сравнительно недавно. Полученные антитела иммобилизуют на нерастворимом носителе и экстракт, содержащий антиген, наносят на колонку. Десорбцию осуществляют обычным способом. Однако при приготовлении сорбента, сорбции и элюировании необходимо иметь в виду высокую лабильность антител в присутствии денатурирующих агентов.

Моноспецифичность антител — важный фактор при использовании их в качестве лиганда. Такие антитела можно получить только путем иммунизации животных высокоочищенными препаратами антигена. Недавно был разработан новый более эффективный вариант метода, позволяющий исключить эти трудности. Мышь иммунизируют смесью антигенов, отбирают клетки селезенки, продуцирующие антитела, и проводят слияние с трансформированными клетками миеломы. Таким образом, получают устойчивые гибриды клеток, продуцирующие антитела, так называемые гибридомы. Каждый отдельный клон таких клеток продуцирует антитела только против одной антигенной детерминанты определенного антигена, т. е. обладает строгой моноспецифичностью. Продуцируемые гибридомой моноклональные антитела могут быть получены в больших количествах в трансформированных клетках in vitro или in vivo в брюшной полости мыши. Полученные этим методом антитела использованы для выделения и очистки различных поверхностных антигенов лимфоцитов методом аффинной хроматографии.

Эффективность применения моноклональных антител может быть продемонстрирована на примере выделения общего лейкоцитарного антигена (L-C-антигена) тимоцитов крысы [7]. На первом этапе с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном лектине чечевицы и гель-фильтрации в присутствии дезоксихолата получают частично очищенный препарат мембранного гликопротеина тимоцитов с молекулярной массой 100 000 (400—900-кратная степень очистки). После иммунизации мыши полученным препаратом отбирают клетки селезенки, продуцирующие антитела к L-C-антигену, и получают гибридомы с клетками миеломы. Клоны клеток, продуцирующие моноклональные антитела, отбирают методом непрямого связывания с радиоактивной меткой и ингибирования частично очищенным препаратом антигена. Аффинная хроматография на иммобилизованных моноклональных антителах позволяет получить препарат L-C-антигена с высокой степенью очистки по данным электрофореза. Достаточно высокий выход антигена после элюирования с колонки в работе [7] объясняется тем, что моноклональные антитела взаимодействуют только с одной антигенной детерминантой в молекуле антигена в отличие от обычных антител, специфичных к различным детерминантам. Необходимо также отметить, что моноклональные антитела мыши отличаются более низким сродством к антигену по сравнению с гипериммунными антителами кролика.