Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Аналитические методы
Фосфорилированные аминокислоты
Гидролиз белка
Фосфоэфирные связи в О-фосфопроизводных серина, треонина и тирозина разрушаются под действием сильных кислот, поэтому для предотвращения деградации этих производных нужно использовать короткое время гидролиза [322]. Лабильностью в кислых условиях объясняется и отсутствие надежного количественного метода определения фосфоаминокислот в белках. Обнаружение аминокислот, содержащих радиоактивную метку [32Р], осуществляют авторадиографией или измерением радиоактивности с помощью счетчика.
Фосфорилированные пептиды могут быть отделены от нефосфорилированных и фракционированы с помощью ВЭЖХ в изократических условиях при 22 °С на колонке сферисорб C18с фосфатным буфером pH 3,2—4,5 и н-гексансульфокислотой в качестве противоиона [114]. Около 0,1 нмоль пептида может быть идентифицировано по поглощению при 210 нм, использование флуоресцентной или радиоактивной метки [32Р] позволяет повысить чувствительность в 100 раз.
Белок обрабатывают 6 М НСl при 110 °С в течение 1—4 ч. Гидролизат фильтруют через фильтр типа Millipore (0,22 мкм) и удаляют НСl в вакууме. Остаток растворяют в 0,001 М ТФУ, добавляют в качестве стандартов немеченые аминокислоты [51].
Фосфогистоны (100 мкг) гидролизуют с помощью 6 М НСl в вакууме при 100 °С в течение 4 ч или инкубированием со 100 мкг протеазы из S. griseus в 50 мМ трис — НСl-буфере (pH 7,5) при 20—24 °С в течение 20 ч [358].
Ферментативный гидролиз [32Р] фосфопротеинов. Растворяют белок в 100 мкл 0,1 М аммонийбикарбоната, содержащего 2 мМ ЭДТА (нейтрализованной) и 250 нмоль каждой немеченой фосфоаминокислоты Ser(P), Thr(P), Tyr(P). Добавляют трипсин (200 мкг/мл) и инкубируют 12 ч при 37 °С в присутствии ЭДТА, которая ингибирует любую фосфатазную активность, внесенную с протеазой. Затем добавляют аминопептидазу М (200 мЕ) и инкубируют еще 12 ч при 37°С (J. Downward, 1984, частное сообщение).