Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Аналитические методы
Аргинин
Методы определения
8.10.1.1. Аргинин в интактном белке [366].
Реагенты
A. 0,1% а-нафтол в 50%-ном этаноле (готовится ежедневно).
Б. 10%-ный КОН.
B. 5%-ная мочевина.
Г. Раствор гипобромита калия (0,64 мл Вr2 в 100 мл 5%-ного КОП; готовится ежедневно).
Д. Исходный раствор аргинина, 1,0 мкмоль/мл.
Методика. Аргинин может быть свободным или связанным в белке. К 1 мл испытуемого раствора, содержащего 0,1 —1,0 мкмоль аргинина, последовательно добавляют по 1 мл реагентов А, Б и В. Тщательно перемешивают и быстро приливают при непрерывном встряхивании 2 мл раствора Г (важная стадия!). Одновременно в глухом опыте проделывают ту же последовательность операций с 1 мл воды вместо раствора аргинина. Оставляют на 20 мин при комнатной температуре, затем измеряют поглощение при 520 им. Определяют концентрацию по градуировочному графику в интервале 0,1 — 1,0 мкмоль/мл.
8.10.1.2. Определение с n-нитрофенилглиоксалем [410].
Реагенты
A. 0,1 М пирофосфат натрия + 0,15 М аскорбат натрия, pH 9,0. Готовится ежедневно с использованием воды, не содержащей азота.
Б. n-Нитрофенилглиоксаль (10%-ный раствор, масс./об.) в метаноле. Готовится ежедневно.
B. Субтилизин (0,1%-ный раствор, масс./об.) в 0,01 М фосфате натрия, pH 7,9.
Г. Бычий трипсин (0,1%-ный раствор, масс./об.) в 1,0 мМ НСl + 20 мМ СаСl2.
n-Нитрофенилглиоксаль готовят из n-нитроацетофенона по методике, описанной в работе [355]. Кипятят в течение 1 ч раствор 39 г (0,30 моль) селеновой кислоты в 24 мл воды, 150 мл ледяной уксусной кислоты и 49,8 г (0,30 моль) n-нитроацетофенона. Охлаждают, выпавший селей отфильтровывают. При перегонке сначала удаляется вода и уксусная кислота (при 15 мм рт. ст.), а затем продукт реакции при 118—128 °С (0,6 мм рт. ст.). При стоянии желтая вязкая жидкость превращается в твердую стеклообразную массу с температурой плавления 37—46 °С. Выход 0,15 моль.
Методика. К 0,20 мл раствора образца белка (1—2 мг), содержащего 0,1 — I мкмоль аргинина, в деионизованной воде или 0,1 М пирофосфате натрия (pH 9,0) добавляют по 40 мкл реагентов В и Г. Инкубируют при 37 °С 3 ч. Охлаждают и разбавляют до 3,0 мл буфером А. Добавляют при размешивании 25 мкл реагента Б и инкубируют при 30 °С 30 мин. Охлаждают ниже 20 °С в ледяной бане и измеряют поглощение при 475 нм против «холостого» образца. Содержание аргинина находят по градуировочному графику, построенному с применением раствора аргинина известной концентрации (в диапазоне 0,03—0,33 ммоль/л L-аргинина в 3 мл реагента А) + 25 мкл реагента Б; для аргинина ε475=0,715.