Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аналитические методы
Углеводсодержащие белки
Определение нейтральных сахаров и аминосахаров в виде альдитацетатов методом ГЖХ

Методика быстрая и простая в экспериментальном отношении. Аминосахара предварительно дезаминируют обработкой азотистой кислотой, в качестве главных продуктов при этом образуются 2,5-ангидроманноза (из глюкозами- па), 2,5-ангидроталоза (из галактозамина) и глюкоза (из маннозамина). Альдитацетаты, приготовленные непосредственно из аминосахаров, имеют значительно большие времена удерживания по сравнению с этими же величинами для производных нейтральных сахаров на обычно используемых колонках.

Дезаминирование. К водному раствору образца (0,1 мл), содержащему до 2 мг аминосахара добавляют 100 мг твердого нитрита натрия. Охлаждают смесь во льду и прибавляют 0,1 мл 9 М серной кислоты, выдерживают 5 мин и затем оставляют постепенно нагреваться до комнатной температуры. Через 25 мин подщелачивают раствор 0,2 мл 15 М водного аммиака, затем восстанавливают и алкилируют по методу, описанному в работе [29].

Восстановление. К 0,1 мл раствора сахара в 1 М аммиаке добавляют 1 мл раствора борогидрида натрия (2%, масс./об.) в безводном диметилсульфоксиде. Выдерживают 90 мин при 40 °С, избыток борогидрида разрушают добавлением 0,1 мл ледяной уксусной кислоты.

Ацетилирование. К восстановленному моносахариду добавляют катализатор 1-метилимидазол (0,2 мл) и затем уксусный ангидрид (2 мл). Перемешивают. Оставляют при комнатной температуре на 10 мин и затем приливают 5 мл воды для разрушения избытка уксусного ангидрида. По охлаждении добавляют 1 мл дихлороэтана, перемешивают. После разделения фаз отделяют нижний слой для анализа методом ГЖХ. Вводят 2 мкл на колонку, остаток хранят при —20 °С.

Газожидкостная хроматография. Стеклянная капиллярная колонка SCOT (28,5 мХ0,5 мм) с жидкой фазой Silar 10С. Температурная программа: нагревание до 190 °С за 4 мин, а затем до 250 °С со скоростью 4 град/мин.

Пятнадцать альдитацетатов дезаминированных аминосахаров были разделены менее чем за 20 мин. Метод применялся к анализу хитина и гликопротеинов.