Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аналитические методы
Обнаружение соединений при хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента
Смешанные методы обнаружения

Система хлор — крахмал — иод [293]. Этот тест на пептидную связь (можно применять после нингидрина) основан на замещении водорода в NH-гpyппax пептида на хлор.

После хроматографии в пиридиновых буферах обязательна отмывка бумаги ацетоном. Затем помещают лист бумаги в камеру, насыщенную хлором, на несколько минут, в течение этого времени нингидриновая окраска исчезает. После тщательного проветривания хроматограммы от следов хлора (вытяжной шкаф!) погружают ее в смесь (1:1) 2%-ного (масс./об.) водного раствора крахмала и 2%-ного (масс, об.) KI. Пептиды проявляются в виде темно-синих пятен на розово-голубом фоне (чем длиннее пептид, тем больше интенсивность окраски).

Аргинин [409].

Реагенты.

А. 0,02%-ный фенантренхинон в безводном этаноле.

Б. 10%-ный NaOН в 60%-ном этаноле.

Методика. Смешивают равные объемы реагентов А и Б непосредственно перед использованием. Погружают в раствор или опрыскивают нм хроматограмму. Высушивают на воздухе 20 мин. Флуоресцентные пятна видны под УФ-светом. Чувствительность определения 10^-4 мкмоль. Далее могут быть применены последовательно нингидрин и диазореагент Паули.

Аргинин [177].

Реагенты для модифицированной реакции Сакагучи.

A. 0,0125%-ный а-нафтол в абсолютном этаноле. Хранят в течение одной недели на холоду в темной склянке.

Б. 1,5 М NaOCl. Хранят 3—4 мес при 0—4 °С.

B. Раствор иода. 22,4 г иода и 30 г KI растворяют в 400 мл дистиллированной воды. Хранят неограниченное время при комнатной температуре.

Г. 10%-ный NaOH.

Методика. Хроматограмму погружают в реагент А и высушивают. Опрыскивают трижды раствором 1,5 мл А +23,5 мл Б и затем один раз смесью 2,4 мл В + 20 мл Г.

Растворы для окрашивания должны быть использованы в течение 10 мин после смешивания компонентов. Аргинин, аргининсодержащие пептиды и многие соединения гаунидинового ряда образуют красное окрашивание, стасильное в темноте в течение нескольких дней (чувствительность <1 мкг). После такой обработки может быть также применен нингидриновый реагент при условии предварительного подкисления уксусной кислотой для нейтрализации избытка щелочи.

Гистидин и тирозин [44]. Применение диазореагента Паули.

Реагенты

A. 0,4 М сульфанилат натрия.

B. 0,4 М нитрат натрия.

В. 0,25 М НCl.

Г. 1 М карбонат натрия.

Методика. Смешивают реагенты А, Б, В и Г в пропорции 1:1:8: 10. Реагент специфичен для гистидина, тирозина и некоторых их производных. Гистидин и гистидинсодержащие пептиды дают ярко-красную окраску, тирозин — коричневую.

Тирозин [293]. Хроматограмму погружают в 0,1%-ный (масс./об.) раствор 1-нитрозо-2-нафтола в ацетоне. Высушивают. Затем погружают в смесь ацетон — концентрированная азотная кислота (9:1). Высушивают и нагревают осторожно (нс перегревая) при 105 °С 2—3 мин. Тирозин дает темнокрасное окрашивание. Тест может быть использован после нингидрина.

Триптофан и имидазолы [344]. Применение реагента Эрлиха. n-Диметиламинобензальдегид в концентрированной НСІ (10%-ный раствор, масс./об.), разбавляют ацетоном (1:4) непосредственно перед использованием.

Методика. После опрыскивания оставляют хроматограмму при комнатной температуре. При этом у триптофана и триптофансодержащих пептидов постепенно развивается фиолетовое окрашивание. Тест может быть использован после нингидрина.

Серусодержащие аминокислоты [333].

1. Система азид натрия — иод. Опрыскивают сухую хроматограмму раствором 0,05 М иода в 50%-ном этаноле, содержащем 1,5% азида натрия. Пятна лучше видны в УФ-свете. Чувствительность определения 0,5 мкг метионина.

2. Применение йодида платины. Смешивают в следующем порядке: 4 мл 0,002 М хлорида платины, 0,25 мл 1 М иодида калия, 0,4 мл 2 М НСl и 76 мл ацетона. Погружают в этот раствор или обильно им опрыскивают хроматограмму. Цистеин, цистин, метионин и восстанавливающие агенты дают белые пятна на красно-фиолетовом фоне. Фенолы и лутидины, использованные в системе растворителей, должны быть удалены промывкой хроматограммы эфиром, ацетоном и т. д.

3. Применение нитропруссида натрия.

А. Растворяют нитропруссид натрия (1,5 г) в 5 мл 1 М серной кислоты. Добавляют 95 мл метанола и 10 мл 28%-ного аммиака. Фильтруют и хранят при 0—4 °С.

Б. Растворяют 2 г цианида натрия в 5 мл воды и разбавляют до 100 мл метанолом. Далее:

а) для обнаружения цистеина используют реагент Л;

б) для обнаружения цистина хроматограмму погружают в реагент А или опрыскивают им. Слегка высушивают и во влажном состоянии обрабатывают реагентом Б;

в) для обнаружения цистеина и цистина готовят растворы реагентов с двойной концентрацией и обрабатывают хроматограмму смесью равных объемов А и В.

Аспарагин [288].

После окрашивания нингидрином хроматограмму погружают в 5%-ный водный раствор бората, промывают водой и высушивают. Аспарагин проявляется в виде голубого пятна.

Аспарагин дает реакцию с нингидрином на хроматографической бумаге, но его идентификация затруднена в тех случаях, когда рядом с ним расположены аргинин, аспарагиновая кислота, глицин, серин или некоторые другие аминокислоты. Обработка боратом приводит к возникновению голубого окрашивания, характерного только для аспарагина. В высковольтном электрофорезе при pH 5,8 аспарагин слегка сдвигается к катоду, а аспарагиновая кислота движется к аноду.

Фосфаты (по Шмидту и Танихаузеру).

Реагенты

Молибдат аммония 1 г (топко измельченный) растворяют в 8 мл воды.

Концентрированная НСl.

Хлорная кислота, 12 моль/л.

Ацетон.

Реагенты берут в соотношении 8:3:3: 86.

Методика. Готовят реагент (смешением указанных объемов компонентов). Погружают в пего бумагу и затем высушивают. При освещении УФ-светом (>30 мин) моно-, ди- и трифосфаты нуклеозидов проявляются в виде голубых пятен.

Сахара [36]. Опрыскивают хроматограмму 6,5 мМ раствором N-(1-нафтил)этилендиаминдигидрохлорида (фирма Baker) в метаноле, содержащем 3% серной кислоты. Нагревают при 100 °С. Цветные пятна (цвет варьирует от коричнево-красного для аскорбиновой кислоты до сине-серого для дезоксиглюкозы) проявляются на белом фоне. Метод может применяется для количественного анализа сахаров.

Применение паров иода. Помещают высушенную бумагу и тонкослойные пластинки в стеклянную камеру, наполненную парами иода. Некоторые производные аминокислот, индолы и другие соединения обнаруживаются по быстрому окрашиванию с образованием темных пятен на бледном фоне.

Другие недеструктивные методы обнаружения см. |12|.

Дополнительная литература. С подробностями применения многих локализующих реагентов можно познакомиться в работах [58, 94, 344]. Описано последовательное применение различных реакций на хроматограммах при пептидном картировании [102].